上海地區兒童快速免疫層析法cTnI參考區間的建立

鄭建新， 楊 慧， 傅啟華

（上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心，上海 200127）

急性心肌損傷的早期診斷是降低兒童病死率的關鍵。目前，臨床診斷心肌損傷的實驗室檢測指標有肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶MB同工酶（creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB）及肌鈣蛋白等[1-2]。肌鈣蛋白是橫紋肌收縮的重要調節蛋白[3]，由3個亞基組成。心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）具有高度的心肌特異性，可用于檢測微小的心肌損傷。cTnI在外周血中出現較早且持續時間較長，因此可作為心肌損傷檢測敏感性和特異性最強的標志物之一，目前主要用于快速診斷急性心肌梗死、監測心臟手術及其預后[4]。兒童心肌損傷常見于窒息缺氧、先天性心臟病、心臟移植、病毒和細菌感染、川崎病、心臟外科手術、使用心臟毒性藥物、冠狀動脈發育異常、新生兒心肌梗死、代謝性心肌病等，且心肌損傷后病情進展迅速。目前，cTnI檢測試劑生產廠商提供的參考區間為該方法的功能靈敏度（臨界值），且多以成人為對象，尚缺乏兒童的參考區間，而兒童因其自身的生理特點與成人有異，因此建立上海地區兒童外周血cTnI參考區間顯得尤為迫切。為此，本研究采用快速免疫層析法檢測健康兒童末梢血cTnI，初步建立該方法的兒童末梢血cTnI參考區間。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年11月1日—2017年4月31日上海兒童醫學中心兒保科完成調查問卷并符合篩選標準的7個月～12歲體檢健康兒童240名，其中男108名、女132名。所有入選兒童血、尿常規及肝、腎功能均正常。調查問卷內容主要包括研究對象的發育及營養狀況、有無心腎肝肺等重要臟器疾病、有無近期服藥史，不涉及兒童姓名。同時查閱研究對象的門診病歷卡，保證調查問卷內容屬實。排除發熱、有心臟疾病史、有嚴重呼吸道疾病史以及近6個月有感染史、使用過藥物的兒童。

1.2 儀器與試劑

銳普200熒光免疫分析儀（加拿大Response Biomedical公司）及配套試劑（快速免疫層析法）、質控品（RAMP cardiac control，批號241013）。Dade Dimension RxL全自動化學發光儀（德國西門子公司）及配套試劑（化學發光法）。

1.3 樣本采集及測定

采集所有兒童手指末梢血后保存于乙二胺四乙酸抗凝管中，室溫保存，2 h內完成檢測。當日測定樣本前測定1次質控品。嚴格按儀器及試劑說明書進行操作。

1.4 方法學評估

在檢測cTnI前先對銳普200熒光免疫分析儀及配套試劑組成的檢測系統進行方法學評估，以確定本方法是否能用于兒童末梢血cTnI檢測。

1.4.1 準確性 將高值質控品（4.69 ng/mL）和低值質控品（0.47 ng/mL）作為樣本進行檢測，每個水平重復檢測10次，計算均值（）。高、低值質控品測定值應在質控品標示的預期范圍（低值為0.38～0.57 ng/mL，高值為3.75～5.63 ng/mL）內。

1.4.2 精密度 （1）日內精密度：將高、低值質控品作為樣本平行測定10次，計算x 、標準差（s）和變異系數（coefficient of variation，CV）；（2）日間精密度：將高、低值質控品作為樣本平行測定5次，連續檢測5 d，計算、s和CV。

1.4.3 最低檢測限 將低值質控品用生理鹽水稀釋16倍，至最低檢測限0.03 ng/mL附近，然后進行檢測，重復測定20次，計算和s，以+2s作為最低檢測限，其結果應＜0.03 ng/mL。

1.4.4 線性范圍驗證 將廠商提供的線性質控品用專用稀釋液稀釋到原來濃度的3/5，得到可讀范圍的高值（26.40 ng/mL），記為點1；另取質控品稀釋到原來濃度的1/2（22.00 ng/mL），記為點2。對點2的濃度進行倍比稀釋，分別記為點3（11.00 ng/mL）、點4（5.50 ng/mL）、點5（1.10 ng/mL）、點6（0.55 ng/mL）、點7（0.028 ng/mL）。每一個濃度樣本均重復檢測3次，計算。用最小二乘法計算實測值與預期值的r值。

1.4.5 方法比對 將本方法與化學發光法進行比對并溯源。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。按Dixon法剔除離群值，如果D/R＞1/3，那該值便作為離群值被剔除，其中R為極差（當前所有值中最大值和最小值之差）、D為可疑值與下一個最值之間差值的絕對值。以百分位數法確定參考區間。

2 結果

2.1 離群值檢驗

Dixon法結果顯示無離群值，因此保留所有測定數據。

2.2 方法學評價

2.2.1 準確度 高、低值質控品的檢測結果分別為4.73和0.49 ng/mL，均在質控品說明書標示的預期范圍內。

2.2.2 精密度 低值質控品日間和日內精密度（CV）分別為5.97%和6.35%，高值質控品日間和日內精密度（CV）分別為5.36%和7.14%，均符合廠家聲明的要求（CV＜10%）。見表1。

表1 精密度驗證結果

2.2.3 最低檢測限 低值質控品稀釋16倍后的檢測結果為0.02 ng/mL，符合廠家聲明的要求（最低檢測限＜0.03 ng/mL）。

2.2.4 線性范圍驗證 在0.028～26.400 ng/mL范圍內實測值與預期值呈正相關（r=0.998 3），線性方程為Y=0.997 4X+0.377 6（r2=0.996 6），符合廠商聲明的線性范圍要求。見圖1。

圖1 線性范圍驗證結果

2.2.5 方法學比對 相關性分析顯示快速免疫層析法（Y）與化學發光法（X）的相關性良好，回歸方程為Y=0.456X+0.011（r=0.988）。快速免疫層析法檢測cTnI的第99百位數值為0.1 ng/mL，第99百位數值的不精密度為18.5%。見圖2。

圖2 快速免疫層析法與化學發光法的相關性

2.3 參考區間建立

將240名兒童的cTnI檢測結果繪制直方圖，見圖3。從圖3可以看出數據呈偏態分布，因此采用百分位數法進行分析。計算99%參考區間上限值，得出參考區間上限值為0.5 ng/mL。若根據廠家給出的參考區間（＜0.3 ng/mL）判斷，240名體檢健康兒童中有200名（83.3%）cTnI＜0.3 ng/mL，有40名（16.7%）cTnI＞0.3 ng/mL。將240名體檢健康兒童按性別分別統計，其結果分布狀態無明顯變化。因此，根據99%參考區間上限值，同時結合試劑說明書中標示的參考區間（＜0.3 ng/mL），確定基于快速免疫層析法的兒童末梢血cTnI參考區間：＜0.3 ng/mL為陰性、＞0.5 ng/mL為陽性。對于cTnI為0.3～0.5 ng/mL的兒童，臨床需結合其癥狀及體征進一步進行相關輔助檢查，以判斷其是否有心肌損傷。

3 討論

中國合格評定國家認可委員會CL-02《醫學實驗室質量和能力認可準則》規定應定期評審生物參考區間。美國臨床實驗室標準化協會C28-A3文件強調確立一個可靠的參考區間時，可引用參考區間并進行驗證，驗證不通過時應建立適合本實驗室的參考區間。

cTnI不僅具有較好的器官特異性，而且窗口期較長，是反映心肌損傷理想的標志物[5-6]。與CK-MB相比，cTnI的相對分子質量較小，心肌損傷后更容易被釋放入血。cTnI 是心肌受到不可逆損傷時釋放出的一種蛋白質，對心肌組織具有很高的特異性[7]。當心肌細胞膜受損時，游離于胞漿中的cTnI被釋放到細胞外，使血清cTnI水平升高，其水平與心肌損傷面積的大小成正比。有研究結果顯示，cTnI在急性心肌梗死發病12～72 h時的敏感性為100%，而72～150 h時僅為18%[9]。兒童的參考區間由于其自身的生理特點不同于成人，但試劑說明書中一般只提供18歲及以上健康成人的參考區間。近年來，各兒童醫院臨床實驗室越來越重視根據檢測系統建立適合自己實驗室的參考區間。建立一個適合本實驗室的cTnI參考區間是非常重要的，可以為心肌損傷患兒提供診斷、預后判斷及療效評價。本研究結果顯示使用廠商提供的參考區間（＜0.3 ng/mL）進行判讀，有16.7%（40/240）的兒童cTnI異常，然而這部分兒童血、尿常規及肝、腎功能指標均正常，心電圖也無異常。由此可見，廠家說明書給出的參考區間（＜0.3 ng/mL）過低，不適用于上海地區兒童末梢血cTnI檢測結果的判斷。本研究通過分析240名健康兒童的cTnI檢測結果，計算99%參考區間上限值為0.5 ng/mL。為避免臨床對就診兒童的誤判，確定基于快速免疫層析法的兒童末梢血cTnI參考區間，即＜0.3 ng/mL為陰性、＞0.5 ng/mL為陽性。對于cTnI為0.3～0.5 ng/mL的兒童，臨床需結合其癥狀、體征并進一步進行相關輔助檢查，以判斷其是否有心肌損傷。總之，本研究建立的參考區間有助于臨床醫生更好地結合患兒實際情況進行疾病的判斷并指導治療。