VISTA信號阻斷對DC-CIK殺傷惡性腫瘤細胞的影響

楊惠寬， 苑召虎， 陳小潔， 魏亞明， 諶丹丹

（1.廣州醫科大學附屬市一人民醫院輸血科，廣東 廣州 510180；2.廣州醫科大學附屬市一人民醫院放射科，廣東 廣州 510180）

T細胞激活抑制物免疫球蛋白可變區結構域（V-domain Ig suppressor of T cell activation，VISTA）是一種新發現的抑制細胞毒性T細胞活化的負調節調控點，類似于程序性死亡受體-配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）。最新的研究結果顯示，由VISAT信號活化引起的細胞毒性T細胞的負調節在腫瘤細胞免疫逃逸中發揮了重要作用[1]。VISTA抗原在髓系造血細胞和Foxp3+CD4+調節T細胞表面呈高表達，在腫瘤細胞表面不表達；抗VISTA單克隆抗體與VISTA抗原結合后可阻斷VISTA信號活化引起的免疫反應負調節，增加外周血中特異性腫瘤T細胞，同時增強其在腫瘤微環境中的滲透能力及增殖、殺傷活性[2-3]。樹突狀細胞聯合細胞因子誘導的殺傷細胞（dendritic cell-cytokine-induced killer cell，DC-CIK）是一種體外誘導的、有特異性殺傷活性的免疫效應細胞，富含VISTA抗原陽性的Foxp3+CD4+調節T細胞，可通過釋放細胞內的穿孔素、顆粒酶等活性物質及Fas-FasL途徑有效殺傷多種血液系統腫瘤細胞、清除放化療或骨髓移植后體內殘余病灶和微小病灶、預防腫瘤復發轉移[4-5]。本研究擬通過對DC-CIK表面VISTA抗原的封閉阻斷來抑制VISTA信號活化引起的免疫反應負調節，以期增加DC-CIK對惡性腫瘤細胞的殺傷活性。

1 材料和方法

1.1 DC-CIK的培養及鑒定

用Ficoll分離液（天津灝洋生物制品科技有限責任公司）分離供者單個核細胞，取外周血單個核細胞層，用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）洗滌并重懸后，置37 ℃、5% CO2培養箱中靜置培養75 min，貼壁細胞加入G70-7551無血清培養基（日本TAKARA公司）進行樹突狀細胞（dendritic cell，DC）培養；懸浮細胞加入細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-induced killer cell，CIK）培養基進行CIK培養；培養至第8天，將腫瘤抗原刺激的DC與上述CIK共培養，培養至第14天，產生一種有特異性腫瘤殺傷活性的免疫效應細胞，即DC-CIK。鑒定：細胞活率＞95%；細菌、真菌、支原體、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）及細菌內毒素檢測全部陰性；CD3+CD56+細胞＞20%，CD3+CD4+細胞＜15%，CD3+CD8+細胞＞50%，CD86+細胞＞5%， 與文獻報道[5]一致。

1.2 DC-CIK與抗VISTA抗體的結合率

培養成熟并鑒定合格后的DC-CIK 800×g離心5 min，棄上清；PBS洗滌2次后，用PBS重懸，調節細胞濃度至106個/mL。取上述細胞懸液1 mL，分別加入1、2 和4 μL兔源性抗VISTA單克隆抗體（美國Abcam公司），即體積比分別為1 000∶1、500∶1、250∶1。室溫下孵育2 h，PBS洗滌2次后，加1 mL PBS重懸，然后加入2 μL Alexa Fluor 594標記的羊抗兔多克隆抗體（美國Abcam公司），室溫下避光孵育1 h。PBS洗滌并重懸，3 h內采用LSRFortessa流式細胞儀（美國BD公司）檢測。

1.3 抗VISTA抗體對DC-CIK殺傷活性的影響

用含10%胎牛血清（美國Invitrogen公司）的培養基將效應細胞（DC-CIK）濃度調整至1×106個/mL，靶細胞[人慢性髓系白血病細胞株K562（南京凱基生物技術有限公司）]濃度調整至50 000和100 000個/mL，分別取100 μL加入相應96孔板中，即效靶比例為20∶1、10∶1，邊緣孔用無菌PBS填充。37 ℃、5% CO2培養24 h后每孔加入20 μL 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT] （美國Sigma公司）溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT，用無菌PBS配置），繼續培養4 h后終止培養，棄去孔內培養液。每孔加入150 μL二甲基亞砜（美國Sigma公司），置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。采用SpectraMax iD5多功能微孔讀板機（美國Molecular Devices公司）測定490 nm處各孔的吸光度（A）值。殺傷活性（%）=[（靶細胞孔A值+效應細胞孔A值-實驗細胞孔A值）/靶細胞孔A值]×100%。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 DC-CIK與抗VISTA抗體的結合率

當DC-CIK與抗VISTA抗體的體積比分別為1 000∶1、500∶1、250∶1時，VISTA陽性的DCCIK比例分別為（9.96±0.54）%、（9.98±0.37）%和（10.26±0.57）%，三者之間差異無統計學意義（P＞0.05）。即使進一步增加抗VISTA抗體的濃度也無法增加二者的結合率。見圖1。

圖1 DC-CIK與抗VISTA抗體不同體積比時DC-CIK表面VISTA抗原的表達情況

2.2 VISTA信號阻斷后DC-CIK殺傷活性的變化

將未經處理的DC-CIK作為對照組，將用抗VISTA抗體處理的DC-CIK作為實驗組。對K562細胞的殺傷活性結果顯示，當效應細胞∶靶細胞為10∶1和20∶1時，實驗組DC-CIK的殺傷活性分別為（77.3±6.8）%和（92.8±5.9）%，均明顯高于對照組[（68.4±4.0）%、（81.8±5.4）%]（P＜0.01）。

2.3 VISTA信號阻斷后DC-CIK增殖的變化

孵育處理54 h后，對照組的細胞數由1.00×106個/mL增加至（2.32±0.31）×106個/mL，實驗組的細胞數由1.00×106個/mL增加至（3.14±0.48）×106個/mL。實驗組細胞數明顯高于對照組（P＜0.01），為對照組的1.35倍。見圖2。

圖2 抗VISTA抗體對DC-CIK增殖的影響

2.4 阻斷VISTA信號對DC-CIK分化的影響

實驗組DC-CIK中CD3+CD56+自然殺傷性T（natural killer T，NKT）細胞（DC-CIK中的主要效應細胞）百分比為（35.12±2.13）%，明顯高于對照組[（21.35±1.32）%]（P＜0.01）。見圖3。

圖3 VISTA抗體處理對DC-CIK分化的影響

3 討論

細胞免疫治療是除手術、放療及化療外一種新發展的治療技術，被美國《Science》雜志評為2013年排名第一的重大科學發現。然而，腫瘤細胞的免疫逃逸使得多種惡性腫瘤細胞能夠逃避免疫效應細胞的識別和攻擊，得以在體內繼續生存和增殖，成為細胞免疫治療面臨的主要挑戰[6-7]。最新的研究結果顯示，VISTA信號的阻斷可通過降低腫瘤微環境中髓系來源的單個核細胞和增加活化的樹突狀細胞來改變腫瘤微環境的抑制性特征；此外，VISTA信號的阻斷還可減少Foxp3+CD4+調節T細胞在腫瘤微環境中的存在，抑制Foxp3+CD4+調節T細胞的免疫抑制活性[1，8]。動物實驗結果表明，抗VISTA抗體可促進免疫效應細胞的增殖、活化及一系列細胞因子[干擾素-γ（interferon gamma，INF-γ）、白細胞介素-2（interleukin 2，IL-2）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等]的分泌，解除T細胞對腫瘤細胞攻擊的束縛，顯著提升免疫系統的腫瘤殺傷活性，可使腫瘤大幅萎縮[8-9]。

DC-CIK是一個新型的免疫活性細胞群體，是將人外周血單個核細胞在體外用多種細胞因子（抗CD3抗體、IL-2、IFN-γ等）誘導擴增一段時間后獲得的一群異質性細胞，其中 CD3+CD56+NKT細胞和CD3+CD8+細胞毒性T細胞在對腫瘤細胞的殺傷中發揮著至關重要的作用。采用DC-CIK進行細胞免疫治療可迅速緩解白血病患者的臨床癥狀，大大延長晚期白血病患者的帶瘤生存時間并改善其生存質量（如增加食欲、改善睡眠、增強體質等）[9]。雖然DC-CIK免疫治療可有效殺傷多種血液系統腫瘤細胞，然而腫瘤細胞的免疫逃逸及機體免疫反應的負調節嚴重限制了DC-CIK臨床療效的發揮[5，10]。因此，一種既有特異性腫瘤殺傷活性，又能抑制腫瘤細胞免疫逃逸的特異性免疫效應細胞將更有利于殺傷和清除體內腫瘤細胞，抑制其免疫逃逸。本研究結果顯示，抗VISTA抗體可特異性地結合于DC-CIK表面，因抗原抗體的結合具有一定的特異性，因此抗體的結合情況亦反映了DC-CIK表面VISTA抗原的表達情況。腫瘤細胞可通過VISTA信號活化引起的DC-CIK免疫反應的負調節發生免疫逃逸。抗VISTA抗體與其抗原結合后可阻斷由VISTA信號活化引起的免疫反應負調節，增加外周血中特異性腫瘤T細胞的數量，并增強其在腫瘤微環境中的滲透能力、增殖能力及殺傷活性[2]。本研究結果顯示，抗VISTA抗體誘導可顯著促進DC-CIK的增殖；此外，抗VISTA抗體體外誘導還可以提高DC-CIK中有效殺傷細胞（CD3+CD56+NKT細胞）的比例。

與傳統的放療和化療藥物的作用機制不同，抗VISTA抗體不是通過直接殺傷腫瘤細胞發揮作用，而是間接通過增強免疫效應細胞的殺傷活性來發揮抗腫瘤作用[8]。 然而，對于免疫缺陷或自身免疫力低下的患者，新型抗腫瘤免疫制劑藥效的發揮將大大受限，而且大部分腫瘤患者由于長期進行放化療，嚴重損傷了自身免疫系統，限制了抗腫瘤免疫制劑藥效的發揮。經抗VISTA抗體處理的DC-CIK可通過在體外擴大培養，使其細胞數目增至體內細胞數目的數百倍以上，不僅可以顯著增加患者特異性抗腫瘤殺傷細胞的數量，彌補其自身免疫力低下的缺陷，而且還可以抑制由VISTA信號活化引起的腫瘤細胞的免疫逃逸。

總之，本研究揭示了抗VISTA抗體增強DCCIK殺傷腫瘤細胞的內在機制，以期能提高細胞免疫治療技術對頑固性血液系統疾病的療效和臨床應用價值。