p53通過調控長鏈非編碼RNA lncRNAp53urlnc對舌鱗癌細胞的影響

周 潔，朱友明，鄒多宏

非編碼RNA(noncoding RNA)是人類基因中不編碼蛋白質的RNA，是人類基因轉錄過程中不可缺少的一部分，主要包括短鏈、中鏈、長鏈非編碼RNA[1]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指長度大于200 nt的非編碼蛋白，是非編碼RNA的重要組成部分，由于其特定的位置及功能，近年來越來越多的實驗證明可以運用lncRNA作為腫瘤的生物標志物和治療的靶向[2]。p53是一種重要的抑癌基因，自1979年被首次報道以來，p53作為抑癌基因的功能逐漸被揭示，且有研究[3]顯示lncRNA的一部分與p53基因通路相一致，這暗示著lncRNA與p53基因在細胞水平上存在聯系。鑒于此，本課題組運用基因芯片技術篩選了一個表達受p53正調控的新lncRNA(ENST00000437008)，命名為lncRNAp53urlnc(p53 upregulated lncRNA)，作為研究對象。該研究主要是為了驗證p53和lncRNAp53urlnc之間的關系，探討其對舌鱗癌細胞的影響，希望為臨床應用提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1細胞人舌鱗癌細胞系SCC3、人胚胎腎細胞系293T、大腸桿菌DH5α均由安徽醫科大學口腔醫學實驗室提供和保存。

1.2主要試劑和儀器高糖DMEM、胎牛血清(美國Gibco公司)；PBS緩沖液(美國Solarbio公司)；胰蛋白酶、嘌呤霉素四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑(美國Sigma公司)；慢病毒包裝試劑(上海和元技術有限公司)；蛋白定量試劑盒、CO2恒溫孵箱(美國Thermo公司)；shlncRNAp53urlnc質粒、shctrl質粒、PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；actin抗體、p53抗體(美國Santa Cruz公司)；山羊抗兔二抗 (北京中杉金橋生物技術有限公司)；RNA提取試劑盒(美國Promega公司)；逆轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑(日本TaKaRa公司)；DNA片段回收試劑盒、質粒提取試劑盒(美國Axygen公司)；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)(上海碧云天生物技術有限公司)；實時熒光定量 PCR 儀(美國Stratagene 公司)；落地恒溫振蕩器(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養 應用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液培養SCC3和293T細胞，置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養箱內培養。當細胞增殖融合達培養皿80%時，使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，按1×104/cm2密度傳代培養。取生長狀態良好的SCC3和293T細胞用于本研究。

1.3.2藥物處理 為了尋找到新的受p53調控的lncRNA，本課題組對含有p53誘導上調系統的H1299細胞進行基因芯片分析(H1299細胞以及相應的基因芯片分析由中國科學技術大學吳緬實驗室完成與提供)，發現了大量的受p53誘導上調和下調的lncRNA。本課題組對其中上調和下調倍數較高的lncRNA進行了驗證，其中一條lncRNA(ENST00000437008)上調變化倍數較明顯，本課題組將其命名為lncRNAp53urlnc(p53 upregulated lncRNA)，lncRNAp53urlnc是一個位于3號染色體長度為838 bp的長片段非編碼RNA，lncRNAp53urlnc共含有5個外顯子。收集生長狀態良好的對數期H1299細胞，制成細胞懸液，以1×106個/孔細胞數接種到6孔板繼續培養。次日，使用含1 μg/ml鹽酸阿霉素的PBS處理H1299細胞，分別于0、6、12 h收集相應時間點獲取H1299細胞的RNA和蛋白，使用Western blot法檢測細胞中p53的表達，使用qRT-PCR檢測細胞中lncRNAp53urlnc的表達。

1.3.3重組質粒載體的構建 本實驗主要使用polk.1和flag質粒載體構建6個質粒載體，具體分為以下3組：① plko.1-shp53及plko.1-shp53-ctrl(中國科學技術大學吳緬實驗室獲取)；② flag-p53及flag空載體(中國科學技術大學吳緬實驗室獲取)；③plko.1-shlncRNAp53urlnc及plko.1-shlncRNAp53urlnc-ctrl。載體引物由上海生工技術服務有限公司設計和合成。Sh-lncRNAp53urlnc-1與Sh-lncRNAp53urlnc-2序列如下: Sh-lncRNAp53urlnc-1:5′-CCGGTATGGGAGGTCTCTGAGATCTCGAGATCTC AGAGACCTCCCATATTTTTG-3′；Sh-lncRNAp53urlnc-2:5′-AATTCAAAAATATGGGAGGTCTCTGAGATCTG AGATCTCAGAGACCTCCCATA-3′。

1.3.4慢病毒包裝和轉染SCC3

1.3.4.1慢病毒包裝 收集對數期生長狀態良好的293T細胞，選擇合適的密度接種于6孔板上，帶細胞增殖融合至培養皿50%時，分別取攜帶上述目的基因片段的載體(2 μg)和病毒包裝質粒(2 μg pGag、2 μg pRev、1 μg pVsvg)共轉染293T細胞，完全培養基培養48 h，收集上清液，0.45 μm PVDF濾器過濾，分裝，-80 ℃冰箱儲存。

1.3.4.2慢病毒轉染 轉染前1 d，收集對數期生長狀態良好的SCC3細胞，選擇合適的密度接種于6孔板上，帶細胞增殖融合至培養皿30%時，加入各病毒液以及2 μl的8 μg/ml polybrene,孵育4 h后加入嘌呤霉素篩選1～2周。

1.3.5qRT-PCR檢測 慢病毒轉染后，分別提取轉染后各組SCC3細胞中的總RNA，進行qRT-PCR定量檢測各組lncRNA的表達水平。使用TRIzol提取試劑盒，按操作指南，分別提取各組細胞的總RNA。采用PrimeScriptTMRT-PCR kit逆轉錄試劑盒合成相應cDNA 。qRT-PCR檢測lncRNAp53urlnc和actin基因的相對表達量，實時定量儀檢測。所有測定進行3次重復。所有PCR引物由上海生工生物工程公司進行設計，引物序列見表1。

表1 基因擴增引物序列表

1.3.6Western blot檢測 慢病毒轉染后，分別于第3天收集細胞，PBS液離心漂洗細胞3次。使用RIPA蛋白裂解液提取蛋白，BCA試劑盒測定各樣本蛋白的濃度，選擇12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。根據蛋白分子量的大小選擇電泳時間，然后轉膜至PVDF膜。5%脫脂蛋白在室溫下封閉2 h后，將膜在p53和actin特異性一抗中4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次，加入對應二抗，室溫孵育1 h，TBST清洗3次。發光檢測儀曝光后收集相應發光信號，分析各組p53相對表達量。所有測定進行3次重復。

1.3.7MTT法檢測 選擇對數生長期狀態良好的SCC3細胞分別轉染shlncRNAp53urlnc和shctrl后，按2×103個/孔均勻接種于96孔板，每組設3個復孔，每孔加入200 μl的DMEM培養液，置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養箱中，分別培養0、6、12、24、48、72 h后，加入MTT(5 mg/ml)20 μl/孔，繼續培養4 h后吸去孔內培養液，加入DMSO 150 μl/孔，避光低速震蕩10 min。使用酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光度值，繪制各組細胞生長曲線。所有測定進行3次重復。

1.3.8集落形成實驗檢測 選取生長狀態良好的對數期shlncRNAp53urlnc和shctrl組的SCC3細胞，常規消化傳代，細胞計數后調整細胞濃度，以3×102個/孔接種于6孔板中，每孔加含10%胎牛血清DMEM培養液2 ml，培養14 d。吸去培養液，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定15 min后使用1%結晶紫染液染色4 h，清洗晾干，肉眼觀察，拍照。

2 結果

2.1p53上調lncRNAp53urlnc表達阿霉素處理H1299細胞后，分別獲取H1299細胞的RNA和蛋白，使用Western blot法檢測細胞中p53的表達，使用qRT-PCR法檢測細胞中lncRNAp53urlnc的表達。經過0、6、12 h梯度時間點顯示，p53和lncRNAp53urlnc的表達均隨著時間而增大，與芯片結果一致。見圖1。

圖1 阿霉素處理H1299細胞后p53和lncRNAp53urlnc的變化

A：加入阿霉素后p53的表達情況；B：加入阿霉素后lncRNAp53urlnc的表達情況

2.2敲低和過表達p53對SCC3細胞中lncRNAp53urlnc表達的影響為了研究lncRNAp53urlnc與口腔癌的關系，本課題組包裝shctrl和shp53病毒，并分別感染SCC3細胞，使用Western blot法檢測細胞中p53的表達，qRT-PCR法檢測細胞中lncRNAp53urlnc的表達。結果顯示，shp53組p53表達明顯低于shctrl組，同時shp53組lncRNAp53urlnc的表達也明顯低于shctrl組(shp53組: 0.283±0.419，shctrl組:1.030±0.638，F=217.558,P=0.001)，見圖2 ；flag空載體和flag-p53轉染SCC3細胞后，使用Western blot法檢測細胞中p53的表達，qRT-PCR法檢測細胞中lncRNAp53urlnc的表達，結果顯示：flag-p53組p53表達水平明顯高于flag組，同時flag-p53組lncRNAp53urlnc的表達水平也明顯高于flag組(flag-p53組：4.725±0.188, flag組：1.021±0.970,F=851.028,P<0.001)，見圖3。以上結果表明：lncRNAp53urlnc的表達與p53呈正相關性。

圖2 敲低p53表達對SCC3細胞中SCC3細胞中lncRNAp53urlnc表達的影響

A：shctrl組和shp53組p53蛋白的表達；B：shctrl組和shp53組lncRNAp53urlnc的表達；與shctrl組比較：**P<0.01

圖3 過表達p53對SCC3細胞中lncRNAp53urlnc表達的影響

A：flag組和flag-p53 組p53蛋白的表達；B：flag組和flag-p53 組lncRNAp53urlnc的表達；與flag組比較：***P<0.001

2.3shlncRNAp53urlnc干擾lncRNAp53urlnc的表達使用qRT-PCR法檢測shlncRNAp53urlnc組和shctrl組中lncRNAp53urlnc的表達水平，結果顯示shlncRNAp53urlnc組lncRNAp53urlnc的水平明顯低于shctrl組(F=191.201,P<0.05)。這表明shlncRNAp53urlnc成功下調lncRNAp53urlnc的表達。見圖4。

2.4shlncRNAp53urlnc對SCC3細胞生長的影響MTT細胞增殖實驗檢測感染shlncRNAp53urlnc病毒后SCC3細胞增殖能力，結果顯示shlncRNAp53urlnc組細胞增殖速度明顯高于shctrl組。采用集落形成實驗來檢測shlncRNAp53urlnc組SCC3細胞集落形成能力，經過14 d顯示：shlncRNAp53urlnc組細胞形成的集落數量明顯高于shctrl組(F=111.722,P<0.05)。結果表明：敲低SCC3細胞中lncRNAp53urlnc的表達可以促進細胞增殖生長。見圖5、6。

圖4 轉染shlncRNAp53urlnc目的基因后對SCC3細胞中lncRNAp53urlnc表達的影響

圖5 MTT法檢測shlncRNAp53urlnc組SCC3細胞數量的變化

圖6 集落形成實驗檢測shlncRNAp53urlnc組SCC3細胞集落情況與shctrl組比較：*P<0.05

3 討論

p53作為重要的腫瘤抑制基因，可能通過抑制與DNA復制相關的細胞基因或基因產物而發揮作用，包括阻滯細胞周期、促進細胞凋亡、維持基因組穩定、抑制腫瘤血管生成等。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。研究[3]表明, lncRNA 在劑量補償效應、表觀遺傳調控、細胞周期調控和細胞分化調控等眾多生命活動中發揮重要作用，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的調控過程，其表達或功能異常與癌癥、退行性神經疾病等關系密切, 具體表現在序列和空間結構上的異常、表達水平的異常、與結合蛋白相互作用的異常等。研究[3]顯示lncRNA和p53信號通路存在顯著的相關性。

p53的反應過程是一個快速的活化過程，并且對細胞存亡有著精密的調控機制，受多種因素調控，例如蛋白質和RNA等。p53蛋白的翻譯后調控是控制p53活化結果的一個重要因素[4-6]。調控p53的一個關鍵因素就是MDM2蛋白，可以通過泛素蛋白酶體途徑結合p53來控制自身的穩定性[7-8]。這樣的磷酸化結果可以通過抑制p53泛素化來維持p53的穩定，并且特定殘基的磷酸化也許是調節p53激活的一條重要途徑[9-10]。除了蛋白質，其他類型的調控分子也可以參與p53的調控，例如microRNA[7]。目前多種腫瘤研究表明，功能性長鏈非編碼RNA與p53存在著密切聯系。

長鏈非編碼RNA主要存在于細胞核與細胞質中的一類RNA，通過將染色質復合物調節到合適的目的基因序列中來實現可調節的特異性[10]。lncRNA可以調節轉錄過程，調節細胞周期，部分lncRNA可以與基因沉默有關的染色質修飾物結合來調節轉錄抑制，如Polycomb組(PCG)蛋白、組蛋白H3賴氨酸9(H3K9甲基化，組蛋白賴氨酸甲基化酶)等；另一方面，部分lncRNA可以通過與表觀遺傳活化因子的相互作用來促進轉錄激活，如H3K4甲基轉移酶MLL1復合物[11]。lncRNA-p21是最早發現的影響p53轉錄的核心組件之一，研究[12]顯示lncRNA下調和抑制p53所產生的基因庫存在大部分的重疊，這也就說明lncRNA-p21是抑制p53表達的主要RNA，此類RNA主要抑制核糖核蛋白K(hnRNP K),這類蛋白是在p53信號通路中作為阻遏基因，與相關基因結合從而抑制p53的合成。lncRNA以往一直作為癌基因或抑癌基因來研究，但近年來越來越多的實驗[3]證明lncRNA和p53信號通路存在顯著的相關性。大量研究[13]已證實p53可以誘導促進lncRNA的生成，而lncRNA也可以通過結合特殊位點影響染色質的構象來促進p53是表達，lncRNA與p53的相互作用可以進一步抑制腫瘤細胞的生長。

舌鱗癌是口腔鱗狀細胞癌中最常見的一種腫瘤，鑒于p53和lncRNA對腫瘤特殊作用，本課題組進行了本研究并加以驗證。實驗表明：細胞在用阿霉素誘導后，p53表達逐漸上調，同時伴隨著lncRNAp53urlnc的上調。構建重組基因載體，分別敲低和過表達SCC3細胞中的p53基因，結果顯示，敲低p53表達時，lncRNAp53urlnc水平下調；過表達p53基因時，lncRNAp53urlnc水平上調，證實lncRNAp53urlnc與p53水平呈正相關性。進一步實驗顯示敲低lncRNAp53urlnc可以SCC3促進細胞增殖。因此，可以得出結論，p53通過正調控lncRNAp53urlnc來抑制SCC3細胞的增殖。但lncRNAp53urlnc是如何受p53基因調控的分子機制仍有待進一步的研究。