激素受體陽性乳腺癌患者CYP2D6基因多態性及拷貝數變異與他莫昔芬治療預后的相關性研究

李涌濤,齊新海,巴合提·哈立亞,張明帥,蔣威華,王曉文,甫拉提·吾瓦力汗

我國乳腺癌發病率呈現逐年上升趨勢，已成為女性高發的惡性腫瘤，其中2/3以上的乳腺癌患者雌激素受體陽性，其發生發展與患者體內雌激素相關[1]。與此相對應，乳腺癌的內分泌治療臨床療效確定、耐受性好，同時經濟、便于患者持久服用，是乳腺癌的重要治療手段。在激素敏感性乳腺癌的輔助治療中，他莫昔芬在乳腺癌內分泌治療領域一直占有主導地位，但是臨床上約有30%～50%的乳腺癌患者對他莫昔芬發生耐藥[2]，近年來，他莫昔芬藥物代謝酶之一細胞色素氧化酶P450 2D6(cytochrome P450 2D6，CYP2D6)遺傳多態變異對他莫昔芬的療效及復發率和生存期具有明顯相關性，該實驗對不同結局的激素敏感性乳腺癌患者CYP2D6基因單核苷酸多態性和拷貝數變異情況進行研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1病例資料選取來自2008年1月～2012年12月在新疆醫科大學附屬腫瘤醫院接受手術的乳腺癌患者，患者均有明確的乳腺癌病理診斷，均為浸潤性乳腺癌，其激素受體陽性，且表達均在10%以上，人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)陽性的患者均接受曲妥珠單抗治療1年，所有患者在化療或放療結束后口服他莫昔芬進行內分泌治療。所有患者在進行內分泌治療前(即接受規范化的化療或放療結束后)進行了相關的檢查，無復發或轉移的臨床征象，所有患者服用他莫昔芬時間超過6個月。本研究通過新疆醫科大學附屬腫瘤醫院倫理委員會審查，所有患者簽署知情同意書。共納入253 例乳腺癌患者進行CYP2D6基因分型和拷貝數變異檢測，這些患者均為女性，年齡28～67歲，其中漢族126例，維吾爾族78例，哈薩克族49例；病理類型浸潤性導管癌239例，浸潤性小葉癌12 例，髓樣癌1 例，黏液癌1 例。患者相關臨床病理資料見表1。

1.2乳腺癌預后的判定及分組局部復發是指在患側乳腺或胸壁發現復發病灶，且均活檢證實，同時將患側所屬區域經活檢證實的腫大淋巴結也定位局部復發。轉移是指非患側所屬區域經活檢證實的腫大淋巴結，或遠處器官，以活檢病理結果作為診斷依據，不易再次病理活檢的以前后影像學資料作為轉移診斷依據。依據此標準入組的乳腺癌患者分為無復發轉移組和復發轉移組，各141例、112例。

1.3CYP2D6基因分型和拷貝數變異檢測留取患者5 ml外周靜脈血，保存在4 ℃的10 ml EDTA 抗凝管中。定期進行DNA 提取。對CYP2D6基因的編碼區、外顯子內含子拼接區進行PCR 擴增，引物序列依據條件和要求進行設定。總體積25 μl 的PCR反應體系包括以下成分：100 ng基因組DNA，15 mmol/L MgCl2，50 mmol/L KCl，10 /mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，200 μmol/L dNTPs，0.5 μmol/L 引物，0.2 μl TaqDNA聚合酶(5 U/μl)(美國Clontech公司)。PCR 反應條件：95 ℃ 5 min 預變性后，進行35個周期的循環(94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，最后一步72 ℃ 5 min)。

CYP2D6基因分型采用TaqMan實時熒光定量PCR技術。CYP2D6基因拷貝數測定采用上海天昊公司的AccuCopyTM多重基因拷貝數檢測試劑盒進行檢測。

1.4CYP2D6的等位基因及相應的代謝表型劃分CYP2D6的等位基因與表型相關性參考人類細胞色素P450等位基因命名的信息委員會的網站(http://www.cypalleles.ki.se)。CYP2D6代謝表型的劃分參考CPIC(Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium)關于藥物基因組學的網站(https://www.pharmgkb.org)。依據CPIC指南將CYP2D6藥物代謝表型分為：超快代謝型(ultrapid metabolizers，UM)、泛代謝型(extensive metabolizers，EM)、中間代謝型(intermedia metabolizers，IM)和弱代謝表型(poor metabolizers，PM)。

1.5統計學處理采用SPSS 17.0軟件進行分析。本研究所有數據為計數資料，兩組患者的基線特征比較、不同預后乳腺癌患者CYP2D6等位基因分布頻率、代謝表型及拷貝數變異情況的比較均采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1患者臨床病理特征及基線特征情況比較將兩組患者的年齡、月經情況、民族、分期、Her-2情況、組織學分級進行比較，差異無統計學意義，基線特征基本一致。

2.2不同預后乳腺癌患者的CYP2D6等位基因多態性及拷貝數檢測結果全部253例乳腺癌患者，無復發轉移組有4例患者、復發轉移組有2例患者血標本未檢測到CYP2D6等位基因突變，即97.6%(247/253)的患者都檢測到了CYP2D6等位基因多態性或拷貝數變異情況。CYP2D6基因多拷貝的發生率為14.3%(36/253)，其中功能型等位基因(*1、*2)多拷貝表達發生率約2.8%(7/253)。依據CPIC指南關于等位基因突變對CYP2D6酶活性的影響，將 CYP2D6的等位基因及相應的代謝表型劃分PM、IM、EM、UM四型，無復發轉移組與復發轉移組患者PM型分別為0.73%(1/141)、1.82%(2/112)，IM型分別為10.22%(14/141)、12.73%(14/112)，EM型分別為83.94%(115/141)、85.45%(94/112)，UM型分別為5.11%(7/141)、0(0/112)。見表2。

表1 兩組患者的基線特征情況比較(n)

2.3不同預后乳腺癌患者CYP2D6基因代謝表型的比較UM型CYP2D6代謝表型患者共7例，均為功能等位基因*1、*2多拷貝所致。無復發轉移組與復發轉移組乳腺癌患者CYP2D6代謝表型分布差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

但是分別將不同代謝表型在兩組患者中的表達變異進行比較(表4)，結果顯示無復發轉移組有7例UM，而復發轉移組未發現有UM，兩組差異有統計學意義(P<0.05)。即存在功能等位基因*1、*2多拷貝的乳腺癌患者，在服用他莫昔芬治療后，效果更好。

2.4不同預后乳腺癌患者CYP2D6基因拷貝數變異的比較CYP2D6基因除有單核苷酸多態性外，還存在拷貝數變異情況，因此又依據CYP2D6不同等位基因的拷貝數情況，對不同預后乳腺癌患者進行比較，結果見表5，可見不同預后兩組乳腺癌患者CYP2D6 基因拷貝數變異的差異無統計學意義。

表2 不同預后乳腺癌患者的CYP2D6等位基因分型及代謝表型結果

表3 不同預后乳腺癌患者CYP2D6基因代謝表型的比較[n(%)]

表4 不同代謝表型在不同預后乳腺癌患者中的表達變異比較(n)

表5 不同預后乳腺癌患者CYP2D6基因拷貝數變異的比較

3 討論

新疆作為西部欠發達地區，在激素敏感性乳腺癌的輔助治療中，他莫昔芬由于經濟、便于患者持久服用，在乳腺癌內分泌治療領域一直占有主導地位。但是臨床上約有30%～50%的乳腺癌患者對他莫昔芬發生耐藥[3-4]。CYP2D6是細胞色素氧化酶P450酶系中的一個重要成員，是他莫昔芬在體內代謝的關鍵酶[5]，相關研究[6]顯示其具有基因多態性，目前已經發現并命名了70多個等位基因。而CYP2D6基因遺傳多態變異則很可能是導致他莫昔芬療效及不良反應的內在因素。在本研究中，253例新疆地區激素受體陽性乳腺癌患者的CYP2D6基因單核苷酸多態性及拷貝數變異情況進行檢測，97.6%(247/253)的患者都檢測到了CYP2D6等位基因多態性或拷貝數變異情況。

在人體內，4-羥基他莫昔芬和4-羥-N-去甲基他莫昔芬與雌激素受體的親和力顯著高于他莫昔芬，是體內抗雌激素的主要活化成分[7]。在CYP2D6代謝酶的介導下，他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬形成4-羥基他莫昔芬和4-羥-N-去甲基他莫昔芬。依據CPIC關于CYP2D6藥物代謝表型指南，將研究的乳腺癌患者分為UM、EM、IM和PM[8]。相關研究[9-10]顯示，攜帶CYP2D6基因多拷貝的超快代謝型個體的4-羥基他莫昔芬和4-羥-N-去甲基他莫昔芬成分顯著高于快代謝型及慢代謝型個體，這揭示超快代謝型個體用他莫昔芬治療效果會更好。本研究顯示預后好的無復發轉移組，有7例UM，而復發轉移組未發現有UM，兩組差異有統計學意義(P<0.05)。這個結果顯示存在功能等位基因*1、*2多拷貝的乳腺癌患者，在服用他莫昔芬治療后，效果更好。這個結果與意大利的一項他莫昔芬預防試驗[11]和德國的一項關于不同基因分型個體接受他莫昔芬治療效果[12]的研究結論相一致。

CYP2D6基因突變發生的主要原因除了有單核苷酸變異(堿基的插入、刪除或重組)，還存在拷貝數變異(copy number variations，CNVs)，即大片段基因的缺失以及基因的復制或擴增[13]。CYP2D6基因CNVs可以引起重要的代謝表型多態性。比如功能型等位基因(*1、*2)多拷貝表達可以引起酶的活性增加。相關研究[6]報道，在高加索人及亞洲人中，CYP2D6*1×2、CYP2D6*2×2的發生率約為0.5%～1.5%，而在非洲人群中約為1.6%～3.3%。在本研究中，CYP2D6基因多拷貝的發生率為14.3%(36/253)，其中功能型等位基因(*1、*2)多拷貝表達發生率約2.8%(7/253)，UM型CYP2D6代謝表型患者均為功能等位基因*1、*2多拷貝所致。將不同預后的乳腺癌患者分為兩組，分別將這兩組患者的拷貝數情況進行比較，差異無統計學意義。因為CYP2D6功能基因多拷貝變異發生率低，本研究樣本例數相對較少，還需要更多樣本量的試驗去進一步的探索。

本研究結果提示，存在功能等位基因*1、*2多拷貝的乳腺癌超快代謝型患者，在服用他莫昔芬治療后，效果更好。但CYP2D6功能基因多拷貝變異發生率低，需要更大的樣本量去研究驗證。CYP2D6基因的多態性及拷貝數變異情況在指導臨床他莫昔芬用藥、預測藥物療效等方面具有重要意義。后期還需要進一步的研究該基因的多態性及拷貝數變異情況，為他莫昔芬個體化治療、提高治療有效性和改善患者生存率提供理論依據。