血清TNF-α及MGP水平與維持性血液透析患者心臟瓣膜鈣化的關系

王 珺，韓林子，張 森，王德光

維持性血液透析(maintenance hemodialysis，MHD)患者常出現骨以外的軟組織鈣化，包括血管鈣化和心臟瓣膜鈣化(cardiac valve calcification，CVC)。心臟瓣膜鈣化是新發心血管事件和心血管死亡的獨立危險因素，也是動脈粥樣硬化、左心室肥厚、動脈鈣化等心血管疾病發病率和死亡率的強烈預測因子[1]。

研究[2]表明，MHD患者體內存在微炎癥狀態并可能參與血管鈣化的形成。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)是一種具有多種生物學效應的細胞因子，也是被證實的在體內外可促進血管鈣化的炎癥因子。但TNF-α與心臟瓣膜鈣化的關系尚無相關研究；基質Gla蛋白(matrix Gla protein，MGP)是血管平滑肌細胞分泌合成的蛋白，具有抑制血管鈣化的作用，參與多種血管病理生理過程。該研究測定MHD患者血清中TNF-α和MGP水平，并探討其與心臟瓣膜鈣化的關系。

1 材料與方法

1.1病例資料病例組選自2016年7月～2016年10月在安徽醫科大學第二附屬醫院腎臟內科病房住院的MHD患者66例。入選標準：① 年齡≥18歲；② 充分透析，每周3次，每次至少4 h；③ 規律血液透析3個月或以上。排除標準：① 急性期感染；② 存在先天性瓣膜畸形、風濕性心臟瓣膜病或行人工瓣膜置換者；③ 合并嚴重心功能不全、嚴重肝病或惡性腫瘤者。MHD患者再根據有無心瓣膜鈣化分為鈣化組(30例)和非鈣化組(36例)。對照組選擇同期健康體檢人群31例，年齡、性別、體質量指數(body mass index，BMI)均與病例組相匹配，無高血壓、糖尿病、結締組織病、慢性腎臟病等病史，體檢肝腎功能、尿常規均正常。人口統計學、臨床和實驗室數據均通過醫院檢查記錄以及問卷調查獲得。

1.2空腹靜脈血樣標本的處理靜脈血標本均清晨空腹采取，離心后收集血清分裝于1.5 ml的EP管中，-80 ℃冰箱凍存。使用前取出至4 ℃冰箱中溶解，待完全溶解后作為實驗樣本。

1.3ELISA檢測血清TNF-α及MGP測定嚴格遵照ELISA試劑盒說明書執行，在酶標儀(Infinite F50)450 nm波長分別檢測TNF-α及MGP的吸光度(optical density, OD)值。以標準物濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準工作曲線，建立擬合標準曲線的方程式，將樣本的OD值代入方程式，計算出樣本的濃度。ELISA試劑盒購自于武漢Bio-Swamp公司。

1.4診斷標準根據2009年改善全球腎臟病預后組織(KDIGO)建議，采用超聲心動圖法(西門子ACUSON+S 2000)檢測心臟瓣膜鈣化[3]。鈣化標準：主動脈瓣瓣膜、二尖瓣瓣膜可探及1個或多個點狀或團狀回聲增強，直徑超過1 mm。

2 結果

2.1一般臨床資料病例組66例，年齡20～80(53.7±14.2)歲。原發病：慢性腎小球腎炎32例(48.48 %)，高血壓腎病9例(13.64 %)，糖尿病腎病7例(10.61 %)，多囊腎7例(10.61 %)，狼瘡性腎病3例(4.55 %)，其他8例(12.12 %)。對照組為31例，年齡、性別及BMI均匹配的健康人群。在病例組中，心瓣膜鈣化者占45.45 %，顯著高于健康人群，差異有統計學意義(P<0.001)。見表1。而在MHD患者中，瓣膜鈣化組平均年齡、透析齡均顯著高于非瓣膜鈣化組，差異有統計學意義(P<0.05)。而這兩組的其他實驗室指標包括血紅蛋白、白蛋白、三酰甘油、總膽固醇、血鈣、血磷、甲狀旁腺激素、堿性磷酸酶、C反應蛋白比較，差異均無統計學意義。見表2。

2.2血清TNF-α及MGP水平比較病例組血清TNF-α水平顯著高于對照組，MGP水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.001)。MHD患者心臟瓣膜鈣化組血清TNF-α水平高于非鈣化組(P=0.027)，MGP水平低于非鈣化組(P=0.001)，差異有統計學意義。見表1、表2。

2.3MHD患者血清TNF-α及MGP水平與臨床指標的相關性血清MGP水平與年齡(r=-0.224，P<0.05)、堿性磷酸酶(r=-0.269，P<0.05)、TNF-α呈負相關性(r=-0.242，P<0.05)；而血清TNF-α水平與年齡、透析齡、血紅蛋白、三酰甘油、總膽固醇、血鈣、血磷、鈣磷乘積、甲狀旁腺激素、堿性磷酸酶均無相關性(P>0.05)。見表3。

表1 研究對象的人口學特征及重要指標

表2 MHD患者心臟瓣膜鈣化組與非鈣化組的比較

表3 TNF-α及MGP與MHD患者臨床指標的相關性

2.4MHD患者心臟瓣膜鈣化的多因素Logistic回歸分析以瓣膜鈣化有無為因變量，多因素Logistic回歸分析顯示，透析齡、血清TNF-α水平是CVC的危險因素(P<0.05，P<0.01)，而MGP是CVC的保護因素(P<0.05)。校正年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、血紅蛋白、白蛋白、C反應蛋白、三酰甘油、總膽固醇、鈣磷乘積、甲狀旁腺激素、堿性磷酸酶后，透析齡每增加1個月，CVC發生風險升高5.3 %；血清TNF-α每增加1 pg/ml，CVC發生風險升高9.9 %；血清MGP每增加1 ng/ml，CVC發生風險減少56.0 %。見表4。

3 討論

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是MHD患者常見的并發癥和首要死亡原因，而心臟瓣膜鈣化是預測MHD患者心血管疾病和全因死亡的獨立危險因素[4]。研究[5-6]顯示，心臟瓣膜鈣化在MHD患者中的發生率為25.5%～58%，該研究顯示，MHD患者心臟瓣膜鈣化的發生率為45.45%，且遠高于健康人群，與既往研究[5-6]結果基本一致。CVC可致斑塊破裂、心肌缺血或梗死，晚期可能出現心律失常甚至心力衰竭等嚴重后果。本研究同賈鳳玉 等[7]研究均顯示，心臟瓣膜鈣化的患者透析齡顯著大于非瓣膜鈣化患者。且透析齡越長，CVC發生率越高。研究[8]顯示，MHD患者發生CVC與鈣磷代謝紊亂、高甲狀旁腺激素血癥、高C反應蛋白密切相關，但該研究并未顯示明顯相關性。可能與該研究樣本量較小，且研究對象有一定特殊性(均為MHD住院患者、病情較重)有關。

隨著年齡增長，骨礦含量逐漸減少，軟組織鈣化出現，故有學者認為瓣膜鈣化與衰老相關，衰老過程伴有細胞內鈣含量的增多，鈣從骨骼向軟組織轉移[9]。該研究顯示，心臟瓣膜鈣化的MHD患者年齡顯著高于非瓣膜鈣化患者，也進一步驗證瓣膜鈣化與衰老相關的觀點。

在全身或局部沒有急性感染跡象時，尿毒癥患者血清炎癥標志物水平仍輕度升高，稱之為“微炎癥狀態”，其實質是免疫炎癥，具有相對隱匿且持續的特點[10]。該研究結果表明MHD患者體內呈微炎癥狀態。筆者認為，在血液透析過程中，反復穿刺動靜脈瘺管、透析液和透析膜的生物不相容性、透析液中內毒素污染、透析用水不純、血管通路感染尤其是深靜脈置管的感染是引起MHD患者血清炎癥因子水平升高的主要原因。在該研究中，伴有CVC的患者血清TNF-α水平明顯升高，揭示TNF-α在瓣膜鈣化過程中起重要作用，具體作用機制需進一步研究證實。

表4 心臟瓣膜鈣化的多因素Logistic回歸分析

MGP是維生素K依賴性循環蛋白，相對分子質量約10 000 bp。體內MGP缺乏的小鼠出生后約2個月就出現了廣泛性的動脈鈣化，最終導致血管破裂而死亡，揭示了MGP參與了動脈鈣化的抑制過程，是體內研究發現的第一個血管鈣化抑制因子[11]。其主要作用機制可能為：① MGP與羥磷灰石結合直接抑制羥磷灰石的增加以及鈣的沉積；② MGP可與BMP-2結合，使其功能喪失，從而抑制血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)向成骨樣細胞表型轉換；③ MGP可能通過抑制VSMC的凋亡(使VSMC維持收縮表型)而直接抑制血管鈣化的發生和發展[12]。MGP主要分布在軟骨、骨髓和動脈壁，在心臟也呈高水平表達。該研究說明了MGP的表達上調限制了瓣膜鈣化的發生。Venardos et al[13]發現，分別從鈣化和非鈣化的瓣膜中分離出瓣膜間質細胞進行體外培養，鈣化的瓣膜間質細胞MGP表達水平明顯減少。這些證據均表明，MGP是心臟瓣膜鈣化的抑制因子，其具體發病機制有待進一步研究。

隨著年齡增大，MGP表達下降甚至失活，機體失去鈣化防御機制，開始出現異位鈣化。堿性磷酸酶是一組同工酶，骨特異性堿性磷酸酶可表達于成骨細胞、軟骨細胞或有鈣化傾向的細胞如鈣化的VSMC，在組織鈣化的發展中起重要作用。高血清堿性磷酸酶被認為是MHD患者冠狀動脈鈣化的獨立危險因素[14]，但該研究并未顯示堿性磷酸酶在CVC組有顯著升高，可能是其他種類堿性磷酸酶代償的結果。

多因素Logistic回歸分析顯示， MHD患者的透析齡及血清TNF-α均為心臟瓣膜鈣化發生的獨立危險因素，校正其他相關因素后，透析齡每增加1個月，心臟瓣膜鈣化發生風險升高5.3 %；血清TNF-α每增加1 pg/ml，心臟瓣膜鈣化發生風險升高9.9%，而血清MGP每增加1 ng/ml，心臟瓣膜鈣化發生風險減少56.0 %，說明MGP是心臟瓣膜鈣化的保護性因素。