ATRA通過ERK/MAPK通路調(diào)控AS兔心臟MLCK的表達

王 雪，余 沛，王 怡，周 青，汪 淵，朱華慶

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種由于脂質(zhì)沉積于動脈管腔，阻礙血液的供應(yīng)進而出現(xiàn)一系列癥狀的疾病，復雜性和慢性進行性是其最主要的特點，對人民健康危害甚大。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)是一種鈣調(diào)素依賴酶，通過磷酸化肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)增強血管內(nèi)皮的收縮及張力，進而增強血管內(nèi)皮的通透性，導致脂質(zhì)更加易于透過血管內(nèi)皮并且附著在血管內(nèi)皮，逐漸形成粥樣斑塊，血管管腔變窄[1]。全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)是維生素 A 的一種衍生物，研究[2]顯示ATRA可以改善內(nèi)皮細胞凋亡、平滑肌細胞增殖、氧化應(yīng)激、炎癥浸潤等多種作用。該研究通過喂養(yǎng)高脂飼料復制AS兔模型，提取心臟組織并且體外培養(yǎng)H9c2心肌細胞，研究ATRA是否通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路調(diào)控心臟中MLCK的表達，為進一步探究AS發(fā)病機制提供依據(jù)并且為臨床治療AS提供新靶點。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑普通雄性新西蘭大白兔，體質(zhì)量(1.8±0.2)kg，購自山東青島康大集團；普通飼料購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心；H9c2細胞購自中國科學院上海細胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基干粉購自美國Gibco公司；棕櫚酸及ERK/MAPK選擇性抑制劑PD98059購自美國Sigma公司；ATRA購自安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所；膽固醇購自中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司(AR級)；ERK、p-ERK、MLCK、GAPDH抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；HE染色試劑盒和BCA定量試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)公司；Masson染色試劑盒購自南京建成生物工程研究所；免疫組化試劑盒購和二抗均購自北京中杉金橋公司。

1.2主要儀器與設(shè)備制冰機(AF100，意大利SCOTSMAN公司)；酶標儀(Thermo MultiskanGO，美國Thermo-Fisher公司)；石蠟切片機(YT-7C型，湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)；正置式生物顯微鏡(DM4000B，德國Leica公司)；CO2培養(yǎng)箱(MCO-20AIC，日本Panasonic公司)，電泳儀(DYY-11型，北京六一儀器廠)；轉(zhuǎn)移電泳槽(DYY-Ⅲ408)；搖床(TS-1型，海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.3方法

1.3.1模型的建立 普通級雄性新西蘭大白兔共24只，通過10 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將其隨機分為3組。正常組用普通飼料喂養(yǎng)；模型組用普通飼料、1%膽固醇和5%豬油喂養(yǎng)；ATRA組在用普通飼料、1%膽固醇和5%豬油喂養(yǎng)的同時給予ATRA灌胃治療5 mg/(kg·d)，12周以后，所有動物全部處死。

1.3.2H9c2細胞的培養(yǎng) 復蘇H9c2細胞，在37 ℃和5%CO2條件下用細胞瓶培養(yǎng)，當細胞數(shù)量達到80%左右，模型組、ATRA組及PD組給予棕櫚酸(10 μmol/L)刺激，6 h后ATRA組給予ATRA(10 μmol/L)；PD組給予PD98059(40 μmol/L)，12 h后提取細胞蛋白進行Western blot分析。

1.3.3標本的制備 3%戊巴比妥將所有動物麻醉，腹部解剖，取出心臟，將用PBS漂洗好的心臟組織用10%福爾馬林溶液固定，隨后用石蠟進行包埋，切片后進行免疫組織化學染色、Masson染色及HE染色；剩余心臟組織放入-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4油紅染色 采用油紅O粉配制油紅O工作液，將動脈壁縱向切開后整體放入油紅O工作液液中浸泡3 min,隨后用60%乙醇調(diào)色，蘇木精用于復染，復染完成后鹽酸酒精分化，自來水沖洗，保存在甲醛溶液中。

1.3.5HE染色 采用石蠟切片機切片，厚度為5 μm，切片脫蠟，梯度至水，蘇木精染色，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化，伊紅染色，自來水沖洗，脫水透明，中性樹脂封片，鏡下觀察。

1.3.6Masson染色 采用石蠟切片機切片，厚度為5 μm，切片脫蠟，梯度至水，核染液染1 min，沖洗液沖洗，漿染液染40 s，沖洗液沖洗，分色液分色8 min，傾去勿洗，復染液復染5 min，無水乙醇沖洗，中性樹脂封片，鏡下觀察。

1.3.7免疫組織化學法檢測MLCK的表達 采用石蠟切片機切片，厚度為5 μm，切片脫蠟至水；枸櫞酸緩沖液煮沸至95 ℃，將切片放入枸櫞酸緩沖液煮沸15 min進行抗原修復，冷卻到室溫，滴加3% 過氧化氫去離子水孵育 10 min，TBS沖洗3遍；滴加一抗，室溫孵育2 h或者4 ℃過夜，TBS 沖洗3遍； 滴加聚合物輔助劑，室溫孵育10 min，TBS沖洗3遍；滴加二抗，室溫孵育 15 min，TBS沖洗3遍，滴加DAB顯色，自來水沖洗、蘇木精復染、梯度脫水、中性樹脂封片，鏡下觀察。

1.3.8Western blot 法檢測 稱取100 mg心臟組織，PBS洗去血漬，用濾紙將組織上殘留的PBS吸干后，放進研磨器，加入1 ml裂解液，于冰上充分研磨成勻漿，研磨完成后，將勻漿吸入EP管中，-80 ℃、4 ℃中反復凍融3次后保存在-80 ℃中。將經(jīng)12 h處理好的細胞用PBS洗3遍，加入200 μl裂解液，冰上裂解30 min，用細胞刮將細胞蛋白刮下，將蛋白液吸入EP管中。4 ℃、14 000 r/min離心30 min，棄去組織沉淀及細胞沉淀，吸取上清液，用BCA法測定蛋白濃度并用生理鹽水配置成同體積同濃度蛋白液，加入蛋白上樣緩沖液，混勻后煮沸變性，放于-80 ℃保存。配制SDS-PAGE凝膠，各組等量上樣電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)移入PVDF膜。5%脫脂牛奶(TBST溶)室溫封閉2 h后TBST搖床洗一遍，TBS洗一遍，進行一抗(GAPDH、ERK、p-ERK、MLCK)4 ℃ 孵育，一抗孵育完成后TBST搖床洗3遍，TBS洗一遍，于37 ℃二抗孵育2 h ，二抗孵育結(jié)束后，TBST搖床洗3遍，TBS洗一遍，于暗室滴加ECL發(fā)光劑，觀察熒光結(jié)果，并覆蓋X膠片顯影。膠片用掃描儀掃描后用QuantityOne軟件分析各條帶的灰度值，以GAPDH為參照，計算ERK、p-ERK、MLCK的相對灰度值。

2 結(jié)果

2.1油紅染色結(jié)果正常組動脈壁光滑并且無明顯斑塊，而模型組出現(xiàn)大量斑塊，結(jié)果顯示造模成功(圖1)。

圖1 動脈油紅染色結(jié)果A：正常組；B：模型組

2.2HE染色結(jié)果正常組心肌組織排列規(guī)則有序，給予高脂飼料后，心肌組織排列出現(xiàn)嚴重紊亂且細胞核排列雜亂無章；給予ATRA后，相比模型組，心肌組織排列較整齊 (圖2)。

2.3Masson染色結(jié)果正常組無明顯膠原纖維堆積，模型組膠原纖維堆積程度升高，與模型組比較，ATRA組心肌膠原纖維堆積明顯減少 (圖3)。

2.4免疫組化結(jié)果模型組MLCK表達量明顯高于正常組，ATRA組相對于模型組而言，MLCK表達量有所降低 (圖4)。

2.5Westernblot結(jié)果與正常組比較，給予高脂飼料12周以后，MAPK通路相關(guān)蛋白ERK的磷酸化水平明顯升高，給予ATAR以后，ERK的磷酸化程度降低(F=62.464)(圖5)。與正常組比較，模型組MLCK表達增加，給予ATRA 以后，MLCK表達顯著降低(F=246.168)(圖6)。與正常組比較，給予棕櫚酸刺激后，MLCK表達水平升高；與模型組比較，經(jīng)ATRA給藥及PD98059后，MLCK表達水平顯著降低(F=134.130)(圖7)。

3 討論

隨著人們生活水平的提高和飲食的多樣化，AS引起的死亡已成為當今人口死亡的主要原因，并愈發(fā)趨向年輕化。目前AS最主要的治療手段是靠他汀類和血管緊張素抑制劑類等藥物緩解[3]，但是AS發(fā)病機制的復雜性與多樣性，他汀類和血管緊張素抑制劑尚不能起到有效的治療，多數(shù)AS患者仍舊遭受疾病的折磨。近年來，相關(guān)領(lǐng)域研究熱點多集中在動脈內(nèi)皮，然而在相關(guān)的死亡調(diào)查中發(fā)現(xiàn)70%與心臟受損有關(guān)。心臟是人體中非常重要的一個器官，是人體中各個器官、組織的血流量的來源，其形態(tài)和功能的完整性對于機體進行正常的生命活動和維持正常的生理功能起著至關(guān)重要的作用。

AS極易引發(fā)多種心血管疾病如心絞痛、心力衰竭等從而降低心臟的順應(yīng)性；心臟缺血，影響心臟收縮功能，導致機體各組織和器官無法正常工作，最終導致死亡[4]。因此采取相應(yīng)預防措施，減輕心臟受損很有必要。

圖2 各組兔心肌形態(tài)變化 HE×400A：正常組；B：模型組；C：ATRA組

圖3 各組兔心肌膠原纖維的變化 Masson×400A：正常組；B：模型組；C：ATRA組

圖4 各組兔心肌的免疫組織化學染色 ×400A：正常組；B：模型組；C：ATRA組

圖5 ATRA對MAPK 途徑中ERK磷酸化的影響

A：正常組；B：模型組；C：ATRA組；與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

圖6 ATRA對MLCK蛋白表達的影響

A：正常組；B：模型組；C：ATRA組；與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

圖7 PD98059對MLCK蛋白表達的影響

A：正常組；B：模型組；C：ATRA組；D：PD組；與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

MLCK是一種存在于哺乳動物中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與許多重要的生命活動，主要由MLCK1基因和MLCK2基因編碼[5]，MLCK2因編碼產(chǎn)物大多分布在橫紋肌細胞而MLCK1基因編碼產(chǎn)物在許多組織如骨骼肌、心肌中均表達[6]。MLCK主要通過磷酸化平滑肌和非平滑肌的肌球蛋白進而調(diào)控肌球蛋白與肌球蛋白之間的細胞黏附、神經(jīng)突起生長及內(nèi)皮細胞和上皮障礙的形成等一系列骨架活動，對肌肉收縮產(chǎn)生重要影響[7-9]。研究[10-12]顯示高血脂、高血糖和高血壓均會引起MLCK發(fā)生不同程度的表達，并且MLCK的不同程度表達對心臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生不同的影響。本研究中免疫組化實驗結(jié)果顯示模型組MLCK蛋白的表達量明顯高于正常組，給予ATRA后表達量明顯下降。因此推測AS心肌損傷與MLCK的表達有關(guān)。

ATRA是維生素A在體內(nèi)經(jīng)兩步代謝而來的產(chǎn)物，臨床主要用于治療急性早幼粒細胞白血病[13]，近年研究[14]顯示ATRA灌胃后能減輕內(nèi)膜增厚和平滑肌細胞增生，在肥胖和AS及其并發(fā)癥防治方面的作用被越來越多的相關(guān)專業(yè)關(guān)注。本研究HE染色和Masson染色結(jié)果顯示模型組心肌纖維發(fā)生一定程度的紊亂與堆積，給予ATRA后，紊亂與堆積程度減輕，表明ATRA可以減輕AS兔心肌損傷情況。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs) 是一種將信號從細胞外傳到細胞核的并引起一些列細胞生物學反應(yīng)的重要信號調(diào)節(jié)酶。MAPK信號通路主要是由ERK、JNK、p38介導的三條級聯(lián)反應(yīng)，參與多種細胞反應(yīng)及機體多種生理病理過程[15]。研究[16]表明MAPK信號通路受到多種刺激發(fā)生級聯(lián)磷酸化被激活，促進細胞因子的生成導致炎癥的發(fā)生。AS的發(fā)病原因復雜多樣，目前沒有確切的說法，但是炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激一直是導致AS發(fā)生的關(guān)鍵原因，因此，MAPK信號通路與AS的發(fā)生發(fā)展密切相連。Benson et al[17]發(fā)現(xiàn)ATRA可以通過MAPK通路途徑抑制血管平滑肌的增生從而有助于AS的防治。ERK主要參與生長因子介導的細胞增殖，而且ERK部分參與心肌細胞基因的表達，是一條經(jīng)典的MAPK信號通路。所以推測ATRA是通過ERK/MAPK通路調(diào)控MLCK的表達。Western blot結(jié)果表明在給予高脂飼料喂養(yǎng)后，ERK磷酸化水平和MLCK的表達呈現(xiàn)一致性，均發(fā)生升高，給予ATRA治療后，磷酸化程度和MLCK的表達水平同時都發(fā)生降低。并且，HE染色和Masson染色結(jié)果均顯示給予ATRA治療后，心肌損傷程度減輕,免疫組化結(jié)果顯示ATRA組心肌中MLCK表達量減少。

綜合本實驗結(jié)果和相關(guān)文獻，本研究顯示ATRA能降低MLCK的表達可能是通過ERK/MAPK通路途徑進行調(diào)控。至于是否通過其他途徑進行調(diào)控需要進一步研究，而ATRA是否可以作為臨床抗AS藥物，明確其作用機制有待深入的探討。