心肌自噬在腎去神經聯合氨氯地平治療高血壓大鼠心肌肥厚中的作用

黃炯華，宋代富，區德錦，謝文杰，戴文軍

高血壓是心力衰竭的重要病因之一，其可以激活交感神經分泌腎上腺素能體液因子，觸發心肌肥厚的發生、發展。部分動物實驗[1-3]和小樣本臨床試驗[4-5]證實，經雙側腎動脈去交感神經治療，可抑制腎交感神經活性降低血壓減緩心臟肥厚的進展。前期動物實驗[6-7]顯示，雙側腎動脈去神經聯合美托洛爾或氯沙坦治療，能抑制自發性高血壓誘導的心肌肥厚。同時，既往血管緊張素Ⅱ刺激心肌細胞肥大模型實驗[8]表明，抑制心肌細胞自噬可減輕心肌細胞肥大。然而，心肌自噬在雙側腎去神經聯合氨氯地平治療高血壓心肌肥厚中的作用仍不明確。該研究擬通過自發性高血壓大鼠心肌肥厚動物模型，探討心肌自噬在腎去神經聯合氨氯地平治療高血壓心肌肥厚中的作用。

1 材料與方法

1.1材料SFP級8周齡雄性自發性高血壓大鼠(spontaneous hypertension rat， SHR)大鼠24只，體質量(142.17±11.35)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，SCXK(京)2016-0001；氨氯地平購自大連美侖生物技術有限公司(MB1725)；RNA逆轉錄及熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；Western blot相關試劑購自上海索萊寶生物科技有限公司；細胞裂解液NP-40及Western發光試劑購自上海碧云天公司；PVDF膜購自瑞士羅氏公司；辣根過氧化物二抗購自武漢博爾德公司；多功能泛素化結合的折疊蛋白(sequestosome1，SQSTM1/p62)和微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體購自美國Epitomics公司。

1.2方法

1.2.1高血壓心肌肥厚動物模型構建及分組 參照先前關于自發性高血壓大鼠的實驗[6]結果，12周齡的SHR可出現高血壓心肌肥厚改變。本實驗以12周齡的SHR作為高血壓心肌肥厚的研究對象。依據是否進行雙側腎動脈去神經治療，隨機分為3組：假手術組(A組)、雙側腎動脈去神經+空白藥物對照組(B組)、雙側腎動脈去神經+氨氯地平組(C組)，共3組，每組8只動物。

1.2.2動物給藥途徑和參照的劑量 根據文獻[9]選定劑量，C組每天給予氨氯地平原藥(MB1725)10 mg/kg灌胃，A、B組的大鼠分別每天給予等體積生理鹽水和等劑量的空白對照藥物灌胃，連續4周。

1.2.3左室體重指數(left ventricular mass index,LVMI)的測定 干預治療4周，大鼠用烏拉坦麻醉處死后，快速獲取心臟，稱全心重(heart weight, HW)，并快速分離左心室并稱量(left ventricular weight, LVW)，以LVW與HW之比計算LVMI。

1.2.4心肌HE染色 干預治療4周，獲取大鼠的心臟，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，心臟橫向切片，HE染色。組織切片顯微鏡觀察并拍圖。

1.2.5肥厚基因的表達的檢測 取100 mg左心室組織剪碎，用TRIzol試劑勻漿，抽提組織總RNA。用RT-PCR試劑盒檢測β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)和心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)的表達量。RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.6自噬標志蛋白定量測定 心肌組織收集后采用NP-40裂解液進行抽提，蛋白濃度通過BCA法測定。約取樣品40 μg蛋白進行電泳分離和轉膜。將承載有目的蛋白膜用5%脫脂奶粉進行封閉1 h，然后加入單克隆抗體p62、LC3和GAPDH于4 ℃孵育過夜。孵育過夜的蛋白膜用PBS-T液洗滌后，加入免疫二抗進行孵育免疫共沉淀反應。免疫復合物通過曝光液進行曝光獲取底片。蛋白相對表達量用內對照蛋白GAPDH標準化后計算獲取。

2 結果

2.1各組大鼠心臟形態及局部病理結構變化獲取心臟標本，觀察形態變化；并行橫切面HE染色，觀察大鼠心肌組織局部的病理變化。結果表明，心臟形態比較可見B組、C組較A組小，以C組更明顯。HE染色：A組室壁較厚，心腔變小，向心性肥厚，B組、C組心室壁厚度明顯減小，見圖1。

圖1 各組大鼠心臟形態及橫切面HE病理切片的改變 SP ×20

2.2各組大鼠LVMI的變化通過計算各組大鼠LVMI并進行比較。結果顯示，A組、B組和C組LVMI分別為(4.43±0.83)×10-3、(3.21±0.61)×10-3及(2.22±0.65)×10-3，組間比較差異有統計學意義(F=85.39，P<0.01)。其中與A組比較，B、C組的LVMI減低；與B組比較，C組降低更明顯，差異均有統計學意義。見圖2。

圖2 各組大鼠LVMI的變化與A組比較：△P<0.05；與B組比較：*P<0.05

2.3各組大鼠心肌肥厚基因表達的變化RT-PCR測定結果顯示，A組、B組和C組ANP的相對表達量分別為(1.03±0.13)、(0.6±0.06)及(0.41±0.07)，組間比較差異有統計學意義(F=89.39，P<0.01)；β-MHC的相對表達量分別為(0.99±0.12)、(0.59±0.06)及(0.32±0.05)，組間比較差異有統計學意義(F=134.22，P<0.01)。其中與A組比較，B組和C組的ANP和β-MHC下調；與B組比較，C組下調更明顯，差異均有統計學意義。見圖3。

圖3 心肌組織肥厚基因(ANP和β-MHC)表達的變化與A組比較：△P<0.05；與B組比較：*P<0.05

2.4心肌自噬活性標志蛋白的表達變化Western blot檢測結果顯示，A組LC3-Ⅱ的表達增加，B組和C組表達減少，組間比較差異有統計學意義(F=3.20，P<0.05)；而B組和C組的p62表達增加，以C組明顯，組間比較差異有統計學意義(F=28.12，P<0.05)。見圖4。

圖4 心肌組織自噬活性標志蛋白(LC3和p62)表達的變化

3 討論

本研究結果顯示心肌自噬活性改變在雙腎動脈去神經治療高血壓心肌肥厚起到重要作用，其中以聯用氨氯地平治療時其效果更明顯。既往實驗[6]表明，12周齡SHR呈現心肌肥厚改變。為此，本研究以12周齡SHR為心肌肥厚的研究對象，探討心肌自噬在腎去神經及聯合氨氯地平治療高血壓大鼠心肌肥厚中的作用。

壓力負荷是致心肌肥厚的重要誘因，心肌肥厚的病理表現為心室壁變厚、心肌重量增加、心肌細胞肥大、心肌纖維化、肥厚基因表達增加。心肌肥厚的持續加劇，會導致患者不良預后，如心源性猝死和心力衰竭[10]。為此，左室肥厚作為心力衰竭的獨立預測因素[11]。目前，本研究12周齡SHR的心肌增厚，肥厚基因表達增加，心肌病理切片顯示肥厚改變，這與既往壓力負荷誘導心肌肥厚的結果一致。同時，本研究結果顯示通過對高血壓心肌肥厚的大鼠施行雙側腎動脈去神經治療或聯合苯磺酸氨氯地平治療均能改善心肌肥厚的相關指標，其中以后者更顯著。

生理水平的自噬反應是機體維持內環境穩定所必需的過程。然而，自噬過度或不足均會導致疾病的發生和發展。既往研究[12]表明，壓力負荷誘導的心肌肥厚，存在自噬的過度激活；自噬的過度激活是壓力負荷心肌肥厚的主要參與者[13]。先前的研究[14]證實，LC3(LC3Ⅱ/Ⅰ)和p62是聯合評價體內自噬活性的標志蛋白，當體內自噬活性增加時，LC3Ⅱ/Ⅰ的表達上調，而p62表達下調；當體內自噬活性受抑制時，其表達側相反。目前本研究SHR誘導的大鼠心肌肥厚的實驗中，LC3Ⅱ/Ⅰ的表達上調，而p62表達下調；經腎去神經治療后，其兩者的表達相反，其中以聯合氨氯地平治療組更明顯。這些結果表明，心肌自噬活性的改變在雙側腎動脈去神經或聯合氨氯地平抑制心肌肥厚中起到重要作用。

綜上所述，筆者猜測腎去神經聯合氨氯地平抑制高血壓性心肌肥厚，其作用可能與心肌自噬活性改變相關。