阿托伐他汀與人血清白蛋白相互作用機制的研究

董 哲，李 陽，謝立娟，劉宗瑞

阿托伐他汀(atorvastatin)通用商品名為立普妥(Lipitor),是由美國輝瑞公司研發的降脂藥[1]。分子內的3-羥基己內酯與HMG-CoA還原酶的底物具有類似的結構，可以作為高選擇性和競爭性的抑制劑[2]。其進入體內無需代謝即可發揮作用，具有見效快、消除半衰期長、代謝慢和降脂作用強等特點[3]。眾所周知，藥物從給藥部位吸收進入人體，通過血液由循環系統運送至體內各臟器組織中，經過不同酶的代謝后排出體外，那么血液就成為體內藥物轉運的樞紐[4]。血液中含量約占60%的蛋白質是人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)，有助于攜帶、轉化和轉運多種內源或外源性物質，如調節血漿中的血滲值和pH值，減少體內自由基等生理功能[5]。一般來說，血清白蛋白和藥物之間的結合作用較強，血漿中游離藥物濃度就會較低；而血清白蛋白與藥物的結合作用較弱，則可能會導致藥物在體內消除時間較快和停留時間較短[6]。藥物在體內的轉運、分布和代謝過程中血清白蛋白都起著關鍵的生理作用，通過了解它們之間的相互作用機制對探討藥代動力學和藥效學也是非常重要的[7-9]。該研究以圓二色譜、熒光光譜、等溫滴定量熱法以及分子對接模擬方法，詳細研究了atorvastatin同HSA相互作用的過程，希望能為進一步闡明小分子他汀類藥物在體內的轉運過程以及作用機制提供基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑圓二色譜儀(Jasco J-810，日本分光株式會社)；熒光分光光度計(970CRT，上海精科)；等溫量熱滴定儀(Micro CalTMITC200，美國馬爾文公司)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101，金壇區岸頭林豐實驗儀器廠)；超聲波清洗器(KQ-500B型，昆山超聲儀器有限公司)。HSA(純度大于98.0%)購自長春鼎國生物技術有限責任公司；atorvastatin購自阿拉丁(aladdin)試劑中國有限公司；實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2實驗方法

1.2.1圓二色譜的測定 在25 ℃下，以Tris-HCl緩沖溶液為參比溶液，測定HSA和atorvastatin溶液的圓二色譜，掃描范圍190～250 nm，分辨率為0.5 nm，響應時間為0.25 s。蛋白質的二級結構含量是通過CD pro軟件計算得到。

1.2.2熒光光譜的測定 在Tris-HCl緩沖溶液中配制一系列含有不同atorvastatin濃度的HSA溶液于石英比色皿中(其中HSA濃度為1.5×10-6mol/L)，搖勻，靜置5 min后，25 ℃下掃描熒光光譜，激發波長280 nm，掃描范圍300～500 nm處的熒光強度。在測定時，以0.02 mol/L 的Tris-HCl緩沖溶液進行熒光校正。

1.2.3等溫滴定量熱的測定 在儀器達到設定溫度后，將經過超聲處理后的atorvastatin藥品溶液作為配體裝入到注射器(syringe)中，將HSA 溶液裝入到樣品池(sample cell)中，攪拌器的轉速為1 000 r/min。實驗開始后，每間隔3 s會把等量的1.5 μl配體溶液滴入到樣品池中，參比池中加入蒸餾水作為樣品池的熱平衡參照。以馬爾文公司提供的oirgin7.0軟件并根據熱力學方程(公式1和2)進行數據處理[10]。在Tris-HCl緩沖溶液中將HSA配制成濃度為10×10-3mol/L的溶液而Catorvastatin=200×10-6mol/L。

ΔG=-RT lnKa

(公式1)

ΔG=ΔH-TΔS

(公式2)

1.2.4分子模擬 HSA晶體三維結構數據(4K2C)文件從Protein Data Bank獲取(http://www.rcsb.org/pdb)，并使用Autodock Tools 為晶體結構加氫加電荷并確定活性位點殘基的質子化狀態。atorvastatin 的3D結構數據從PubChem數據庫獲取(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)。使用Sybyl-x2.0軟件對蛋白受體和藥物配體進行剛性分子對接和收集，選取打分最高的對接結果導入至Ligplot+軟件中，進而分析復合物中相關氨基酸殘基的信息[11]。

1.3統計學處理實驗數據均重復3次，取其平均值。采用Origin 8.5軟件進行處理和作圖，采用SPSS 15.0統計軟件進行Duncan顯著性分析，以P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1圓二色譜法實驗考察了atorvastatin加入對HSA的二級結構的影響。HSA(濃度為1.0×10-6mol/L)在195 nm處為正峰，208 nm和220 nm處為負峰顯示了典型α-螺旋的結構，見圖1。在溫度為25 ℃且pH為7.4的緩沖體系下，隨著藥物逐漸加入到HSA中，HSA的α-螺旋含量從58.34%(Catorvastatin/CHSA=0)逐漸減少到28.13%(Catorvastatin/CHSA=10.0)。

圖1 atorvastatin與HSA相互作用的CD光譜圖a:Catorvastatin/CHSA=0；k:Catorvastatin/CHSA=10.0

2.2熒光光譜實驗HSA中包含色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)殘基可以發射較強的內源性熒光。在溫度為25 ℃且pH為7.4的Tris-HCl緩沖體系下，隨著atorvastatin逐漸加入到HSA中，發生了顯著地熒光淬滅，見圖2。在此過程中，最大發射峰位于346 nm且保持不變。

動態淬滅和靜態淬滅是造成蛋白質熒光淬滅兩種不同方式，根據Stern-Volmer 方程可以確定其熒光淬滅的類型。

F0/F = 1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(公式3)

τ0為不存在淬滅劑分子時蛋白質分子的平均壽命，約為 5 ns，而各類淬滅劑對生物大分子的最大碰撞淬滅常數為2.0×1010L/(mol·s)。通過 F0/F對加入的atorvastatin總濃度[Q]來作圖可獲得 atorvastatin與HSA的Stern-Volmer淬滅曲線，見圖3；依照公式3進行分析，得到的淬滅常數見表1。

圖2 atorvastatin與HSA相互作用的熒光光譜圖a:Catorvastatin/CHSA=0；k:Catorvastatin/CHSA=10.0

圖3 不同溫度下atorvastatin與HSA的Stem-Volmer曲線

對于動態淬滅過程屬于分子擴散，體系溫度升高KSV相應地增大；反之靜態淬滅過程隨著體系溫度升高，基態復合物穩定性下降造成KSV相應地減小。本研究數據顯示隨著溫度由25 ℃升高到45 ℃，然而KSV由3.296降到2.03。另外，Kq值遠遠大于生物大分子最大的Kq值為2.0×1010L/(mol·s)，表明了atorvastatin與HSA不是分子碰撞過程，而是靜態淬滅過程生成了不發射熒光的復合物。見表1。

2.3ITC實驗在Tris-HCl (20×10-3mol/L,pH 7.4)緩沖液體系中溫度為25 ℃時，atorvastatin (200×10-6mol/L)與HSA溶液(10×10-3mol/L)相互作用的情況進行了研究，見圖4。通過數據擬合計算，得到了結合位點數(n)，結合常數(Ka)和結合過程的焓變ΔH，還通過熱力學公式(1和2)計算得到的吉布斯自由能變ΔG和TΔS，見表2。

表1 不同溫度下atorvastatin與HSA的Stem-Volmer淬滅常數

圖4 atorvastatin與HSA的等溫滴定量熱反應實驗

nKa (mol/L)ΔH(kcal/mol)ΔG(kcal/mol)TΔS(kcal/mol)1.23±0.02 (2.31±0.12)×105-6.132±0.05-7.29±0.061.18±0.11

由表2，得到ΔG<0, ΔH<0, TΔS>0，atorvastatin與HSA的結合是自發的熵驅動放熱過程。它們間結合常數Ka為2.31×105mol/L，結合位點數為1.18。

2.4分子對接研究為了獲得更多的關于atorvastatin與HSA相互作用的信息，采用SYBYL軟件對配合物與受體蛋白的識別進行了分子對接研究。HSA是由585氨基酸殘基組成，含有3個相似的結構域，分別是Domain Ⅰ (1～195)、Domain Ⅱ(196～383)、Domain Ⅲ (384～585)，每個結構域又可分為兩個不同的亞結構域(A、B)，3個亞結構域構成了疏水性的圓筒狀結構。分子對接分析表明藥物主要結合在HSA的亞結構域Ⅱ A的表面疏水性空腔中，所擁有的最低能量的優化分子結構圖，見圖5。

atorvastatin與HSA結合形成復合物后，與周圍環境中Lys199、Ala209、Phe211、Trp214、Ala215、Arg218、Leu219、Lys221和Ile233等疏水性氨基酸殘基存在氫鍵作用形成了一個疏水性活性口袋。atorvastatin與Lys199殘基間距離為3.12 nm，與Arg218之間距離為2.91 nm，并且與這兩個殘基之間存在氫鍵作用。atorvastatin在進入這個疏水口袋后，引起了Trp213殘基周圍的微環境受到了影響，從而淬滅HSA的熒光發射。見圖6。

圖5 atorvastatin與HSA相互作用的分子模擬對接圖

圖6 atorvastatin與HSA分子間相互作用網二維圖分析

3 討論

本文采用圓二色譜、熒光光譜、等溫滴定微量熱法以及分子對接相結合的方法，系統地研究了在模擬人體生理條件(pH 7.4)中HSA與藥物小分子(atorvastatin)的相互作用。圓二色譜結果表明在atorvastatin的作用使得血清白蛋白微環境中的某些疏水性氨基酸殘基暴露出來，會改變HSA的二級結構，進而影響其生理功能；熒光光譜的結果表明atorvastatin與HSA 的主客體間相互作用為靜態猝滅并形成了不產生熒光的復合物；量熱學實驗表明由 atorvastatin進入到HSA的表面疏水空腔后，通過自發的熵驅動放熱作用進行的小分子藥物和血清蛋白結合過程，還通過疏水-疏水作用和氫鍵作用進而改變蛋白的折疊狀態并將水分子從空腔中釋放到周圍環境中。它們間的結合常數可以表明是中等偏弱強度的結合，形成較為穩定的配合物，同時在一定條件下又便于解離，從藥代動力學來講，合適的結合常數有利于血清白蛋白將藥物運送到目標位置。結合位點數可近似看為1，說明1個藥物分子只是結合1個血清白蛋白；分子對接計算結果表明藥物結合在HSA的Trp214附近且處于疏水口袋中，同時也證實了主客體之間存在較強的疏水及氫鍵作用。本文可能會為高通量研究藥物小分子與蛋白相互作用以及藥物快速篩選、藥代動力學等方面提供一定的科學依據。