sFasL及其受體在雙陰性T細胞殺傷胰腺癌細胞中的作用及意義

胡丕波，陳 炯，鄔高華，周海波，趙金錢，楊旭東

近年來雖然醫(yī)療水平在不斷的進步，癌癥的治療效果逐年提高，但是胰腺癌卻是其中的一個例外，其起病隱匿，病情發(fā)現(xiàn)較晚，且極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，常規(guī)方法治療預后不佳，5年生存率一直低于5%[1-2]。國際上熱門的“免疫療法”成為癌癥目前治療手段中最有前景的方法之一。“過繼免疫”的提出更讓人們看到了治愈腫瘤的曙光。其中雙陰性T細胞(double negative T cell，DNT cell)由于其明顯的抗腫瘤作用引起了眾多研究者的關(guān)注。楊仁保 等[3]在利用裸鼠模型進行的體內(nèi)實驗中顯示DNT細胞可以殺傷胰腺癌細胞，但是其具體的殺傷機制尚無定論。Chang et al[4]研究報道了可溶性的FasL與其受體Fas結(jié)合介導肺癌細胞的凋亡，這為課題組提供了新的思路。該研究的目的是探索sFasL/Fas是否參與了DNT細胞殺傷胰腺癌細胞。

1 材料與方法

1.1病例資料人胰腺癌細胞株P(guān)anc-1、BXPC-3、Capan-1(中科院上海細胞庫)。人胰腺癌組織蠟塊標本和癌旁組織蠟塊標本各60例(距離癌組織>1 cm)。均取自2014年3月～2017年8月安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院膽胰外科行切除術(shù)且病理證實為胰腺癌的組織。其中男34例，女26例；年齡(60.15±12.32)歲。所選患者術(shù)前均未進行過放療、化療等抗腫瘤治療。同時收集這60例胰腺癌患者的臨床病理資料。分離DNT細胞的人外周血標本取自未服用藥物、無免疫性疾病的健康人群。腫瘤分期參照美國癌癥委員會TNM分期手冊第7版。

1.2主要試劑胎牛血清(杭州四季青公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；FasL ELISA試劑盒(美國R&D Systems 公司)；CD4 +、CD8 + 去除液(加拿大Stemcell Technologies 公司)；白介素2(interleukin-2, IL-2)、白介素4(IL-4)、抗人T 淋巴細胞表面CD3 (OKT3)抗體(美國eBioscience 公司)；人外周血淋巴細胞分離液(天津灝洋公司)；兔抗人Fas抗體(英國Abcam公司)；蛋白提取試劑盒(南京Keygen 公司)；實時定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)；TRIzol(美國Invitrogen 公司)。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng) DNT細胞的培養(yǎng)采用OKT3抗體吸附法。將CD4、CD8去除液(50 μl/ml)加入肝素鈉抗凝的10 ml健康人外周血中，靜置孵育20 min后，緩慢加入到含有等量淋巴細胞分離液的離心管中，保持液面分層然后離心，吸取中間云霧層細胞兩次洗滌，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞，然后接種到OKT3包被的培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2恒溫條件下靜置培養(yǎng),每隔3 d滴加IL-2(1 μl/ml)和IL-4(1 μl/ml)促進生長。2～3 d換液，6 d移至較大的培養(yǎng)瓶中,12～13 d使用細胞。胰腺癌細胞培養(yǎng)：3株胰腺癌細胞均使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基靜置于37 ℃、5%CO2條件下恒溫培養(yǎng)，2～3 d換液傳代。

1.3.2Fas mRNA 檢測 采用qRT-PCR法，首先按照TRIzol試劑盒說明書提取3株胰腺癌細胞的RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。使用qPCR試劑盒進行擴增反應，反應體系為10 μl。Fas上游引物：5′- TTGCTTAGGGTTCCCTCCTG-3′，下游引物：5′-AAACTGGAGAGCAGACAGCA-3′。β-actin上游引物：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG -3′，下游引物：5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG -3′。qPCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計算mRNA表達量，實驗重復3次。

1.3.3Fas蛋白檢測 采用Western blot法，收取3株胰腺癌細胞并加入RIPA細胞裂解液提取蛋白，按照1 ∶4加入5×上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min冷卻后上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，半干轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉；滴加Fas一抗，4 ℃過夜；加入適當稀釋度的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育2 h，然后PBST洗滌3次；加入ECL曝光液，曝光顯影后，使用Image J軟件進行條帶分析。

1.3.4sFasL檢測 采用ELISA法,將DNT細胞(5×106/ml)的培養(yǎng)液(換液過夜)作為實驗組，將未培養(yǎng)DNT細胞的培養(yǎng)液(換液過夜)作為對照組，各取100 μl進行檢測，按照ELISA試劑盒進行操作，讀取OD值，計算兩組sFasL的濃度。

1.3.5人胰腺癌組織Fas蛋白檢測 采用免疫組化法，取胰腺癌石蠟切片脫蠟后檸檬酸鹽高壓修復，緩慢冷卻至室溫，然后使用內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑消除內(nèi)源性過氧化物酶活性(30 min)，PBS沖洗3次，再滴加一抗Fas(1 ∶200)，4 ℃過夜，次日室溫下放置30 min，PBS沖洗3次，隨后滴加二抗孵育30 min，PBS沖洗3次，加入適量DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，烘箱烘干，最后中性樹脂封片。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0軟件進行分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，3組均數(shù)比較采用方差分析，定性資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1DNT細胞鏡下形態(tài)DNT細胞從健康人外周血中分離提取，最初細胞數(shù)量較少(1×105/ml)，呈現(xiàn)懸浮生長狀態(tài)，經(jīng)過IL-2和IL-4的促進生長作用，細胞數(shù)量緩慢增加，13 d左右的可達到飽和狀態(tài)(細胞數(shù)量為5×106/ml)，見圖1。

圖1 DNT細胞形態(tài) ×200

2.2FasmRNA在3種胰腺癌細胞中的表達差異PCR結(jié)果顯示mRNA在3種胰腺癌細胞中表達均有表達，3組之間的差異有統(tǒng)計學意義(F=211.56，P<0.05)，相互比較結(jié)果顯示Capan-1表達量低于BXPC-3(P<0.05)，Panc-1表達量高于BXPC-3(P<0.05)，見圖2。

圖2 3種胰腺癌細胞中Fas mRNA的表達情況

1: Capan-1; 2: BXPC-3; 3: Panc-1; 與BXPC-3細胞比較：*P<0.05

2.3Fas蛋白在3種胰腺癌細胞中的表達差異Western blot結(jié)果顯示Fas蛋白在3種細胞中均有較高表達，由低到高順序為Capan-1、BXPC-3、Panc-1。見圖3、4。

圖3 3種胰腺癌細胞中Fas蛋白的表達情況

圖4 3種胰腺癌細胞中Fas蛋白的表達量1:Capan-1; 2: BXPC-3; 3:Panc-1

2.4sFasL在DNT細胞培養(yǎng)液中的含量ELISA法檢測了20例健康人外周血來源分離培養(yǎng)的DNT細胞(5×106/ml)上清液以及未培養(yǎng)DNT細胞的上清液，結(jié)果顯示培養(yǎng)DNT細胞組上清液中sFasL含量為(64.52±2.21)pg/ml，對照組上清液中含量為(55.68±1.95)pg/ml，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.00，P<0.01)。見圖5。

圖5 DNT細胞上清液和對照組中sFasL的含量與對照組比較：**P<0.01

2.5Fas在胰腺癌和癌周組織中的表達免疫組化結(jié)果顯示Fas蛋白主要的表達部位是在細胞質(zhì)，胰腺癌組織的陽性表達率為42%(25/60)，在癌周組織的陽性表達率為68%(41/60)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.62，P<0.05)。見圖6。

圖6 Fas蛋白在胰腺癌和癌周組織中的表達情況 ×200

A：Fas在胰腺癌組織中的陰性表達；B：Fas在胰腺癌周組織中的陽性表達

2.6Fas的表達與臨床資料的相關(guān)性Fas在胰腺癌組織中的表達與腫瘤的分化程度、神經(jīng)浸潤有關(guān)(χ2=5.659、6.251，P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無關(guān)。見表1。

表1胰腺癌組織中Fas蛋白的表達與臨床病理關(guān)系(n)

臨床病理特征nFas陽性例數(shù)Fas陰性例數(shù)χ2值P值性別 男3416180.9390.333 女26917年齡(歲) ≤602710170.4330.511 >60331518腫瘤位置 胰頭3116152.6110.106 胰尾29920分化程度 高231495.6590.017 中低371126TNM分期 Ⅰ～Ⅱ3818201.3860.239 Ⅲ～Ⅳ22715神經(jīng)浸潤 有339246.2510.012 無271611淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有3819192.9610.085 無22616

3 討論

胰腺癌是惡性程度極高的消化道腫瘤，雖然現(xiàn)代外科技術(shù)的發(fā)展使胰十二指腸切除術(shù)圍手術(shù)期死亡率降至5%以下，但是30年來胰腺癌的長期存活率并未發(fā)生顯著改變。DNT細胞在各項疾病中均起到了關(guān)鍵的治療作用，特別是其抗腫瘤作用已成為人們關(guān)注的點。Lee et al[5]研究發(fā)現(xiàn)DNT細胞可以抑制急性白血病細胞的生長。Xu et al[6]通過實驗證明了DNT細胞通過NK細胞活化性受體(NKG2D) 及其配體主要組織相容性復合體I類相關(guān)基因A(MICA)途徑殺傷胰腺癌細胞。最近有研究[4]報道sFasL/Fas可以介導殺傷肺癌細胞。而本研究在DNT細胞上清液中檢測出了sFasL的表達，同時在胰腺癌細胞中檢測出其受體Fas的高表達，所以筆者有理由推測DNT細胞可以通過分泌sFasL與胰腺癌細胞表面的Fas結(jié)合介導殺傷胰腺癌細胞。

Fas是屬于TNF受體超家族成員的I型跨膜蛋白，與腫瘤壞死因子(TNF)受體具有一定的同源性。Fas的基因位于10號染色體，其基因分子長度為25 kb，共編碼了325個氨基酸。Fas蛋白可分為膜表達型(mFas)和可溶型(sFas)兩種形式。mFas分為3個部分：胞外部分、跨膜部分、胞內(nèi)部分，其中胞內(nèi)含有死亡結(jié)構(gòu)域，可傳遞細胞凋亡信號。FasL屬于TNF配體超家族，是一種分子量40 ku的Ⅱ型跨膜蛋白，其基因位于1號染色體，共編碼281個氨基酸，其蛋白分子同樣也分為膜型(mFasL)和可溶型(sFasL)。Fas與FasL在體內(nèi)是天然的受體與配體關(guān)系。Fas與FasL結(jié)合后，凋亡信號開始傳遞，受體分子中的死亡結(jié)構(gòu)域構(gòu)像改變，然后通過與死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(Fas-associated death domain, FADD)的C末端結(jié)合傳遞信號，信號在FADD中又通過N末端與caspase8結(jié)合，開啟半胱氨酸蛋白酶(caspase)分子的級聯(lián)反應，使得細胞凋亡[7-9]。Fas與FasL的結(jié)合，是細胞凋亡的關(guān)鍵步驟，所以癌細胞表面Fas受體的表達量對研究FasL是否參與細胞凋亡具有重要意義。

表達Fas的靶細胞與FasL結(jié)合后，靶細胞就會被誘導進入死亡程序，維持著人體細胞凋亡與增殖的平衡[10]。本研究在胰腺癌細胞和組織中均檢測了Fas的表達情況，其結(jié)果為：Fas mRNA在3株胰腺癌細胞中均有表達且存在一定差異，F(xiàn)as蛋白在胰腺癌細胞中均有較高表達且表達差異與RNA的表達差異一致。而在免疫組化法檢測胰腺癌組織和癌周組織的結(jié)果中顯示：Fas蛋白在胰腺癌組織中表達較癌周組織表達較低，且低分化組織中的表達量明顯低于高分化組織。從中可以表明，F(xiàn)as在胰腺癌組織中的表達下調(diào)，與其配體FasL的結(jié)合減少，導致胰腺癌細胞凋亡減少，發(fā)生免疫逃逸，細胞凋亡與增殖的動態(tài)平衡被打破，使得胰腺癌快速的發(fā)生發(fā)展得以進行。