轉錄因子Twist與Snail在胎盤植入孕產婦胎盤中的表達及其與上皮間質轉化關系

陳先俠，王海霞，盧曉倩，蔣曉敏，李 兵，呂紅梅

胎盤植入(placenta accreta)是一種較為嚴重的妊娠并發癥，指胎盤的絨毛滋養層細胞不同程度的侵入子宮肌層。近年來，隨著孕婦剖宮產次數和人工流產次數的增加，胎盤植入的發病率顯著增高[1]。胎盤植入可引起嚴重不良妊娠結局，危及孕產婦和胎兒的生命。目前，子宮因素(子宮蛻膜、肌間血管重塑障礙)和滋養細胞侵襲能力增強是影響胎盤植入發病的主要因素[2]。在某些生理和病理情況下，上皮細胞可以向間充質細胞轉化，即上皮間質轉化(epithelial- mesenchymal transition，EMT)，是腫瘤形成、腫瘤浸潤轉移和惡性發展的關鍵環節[3]。轉錄因子Twist和Snail基因最先在果蠅中被發現，與胚胎生長發育中細胞遷移調控相關，是EMT最基本的轉錄因子，具有癌基因的特征，在惡性腫瘤中呈現高表達，早期參與調控EMT，影響腫瘤細胞的遷移和侵襲[4]。Twist和Snail基因參與EMT調控，對胚胎發育和腫瘤的轉移發揮重要調控作用，而胎盤植入發病中，滋養細胞向子宮內膜的侵襲類似于腫瘤細胞具有的遷移和侵襲特點，同時，在EMT中，波形蛋白(Vimentin)是最為重要的一種基質形成的彈性蛋白[5]。該研究通過檢測Twist、Snail在正常胎盤和絨毛植入胎盤組織中的表達，探討Twist、Snail與滋養細胞侵襲性的關系，以及EMT在胎盤植入中聯系，旨在進一步認識胎盤植入發病機制。

1 材料與方法

1.1病例資料178例胎盤組織為2013年1月～2017年12月在醫院定期產前檢查和分娩的孕產婦，其中正常對照者42例(對照組)，136例胎盤植入孕產婦(胎盤植入組)分娩后均經兩名病理科醫師獨立閱片確診，參照文獻[6]中華醫學會《胎盤植入診治指南(2015)》的植入程度分組：分輕度組(47例)，即胎盤粘連，胎盤絨毛植入侵及子宮肌層；中度組(45例)，胎盤絨毛植入深層≥子宮肌層1/2，但未侵及子宮漿膜層；重度組(44例)，即穿透性胎盤植入，胎盤絨毛植入穿透至子宮漿膜層，可侵及子宮外膀胱或直腸等鄰近組織。兩組一般情況見表1。與對照組比較，胎盤植入組孕產婦的年齡增大，妊娠次數和流產次數增多，分娩孕周較小(P<0.05，P<0.01)。納入該項研究的孕產婦均排除圍產期心肌病、妊娠期高血壓、糖尿病和胎膜早破等病史。對照組和胎盤植入組孕產婦對本次研究胎盤標本收集處理均知情，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本和試劑 胎盤娩出后，迅速取胎盤母體面的胎盤組織2塊(約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm)，取材時，正常組選取母體面胎盤中間帶部位，胎盤植入組選取粘連或植入部位，注意避開出血、壞死、鈣化處。用于Western blot檢測的一塊組織迅速置于-80 ℃冰箱保存備用；另一塊標本常規處理制備石蠟切片，進行免疫組織化學檢測，標本固定于10%福爾馬林溶液。主要試劑包括：兔抗人Vimentin多克隆抗體、羊抗人Twist多克隆抗體、羊抗人Snail多克隆抗體、羊抗人β-actin多克隆抗體均購自美國Santa Cruz生物技術有限公司；即用型SP免疫組化和二氨基聯苯(DAB)顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

表1 兩組孕產婦的一般臨床資料比較

1.2.2免疫組化檢測Twist、Snail蛋白表達和結果數量判定 采用免疫組織化學SP法檢測蛋白表達，操作步驟嚴格按照使用說明書進行。胎盤組織常規脫水、石蠟包埋，厚4 μm 連續切片，烤片、脫蠟、微波抗原修復，山羊血清封閉，滴加一抗(Twist，抗體稀釋度為1 ∶100；snail，抗體稀釋度為1 ∶150)50 μl，4 ℃孵育過夜，沖洗后滴加生物素標記的二抗(1 ∶200 稀釋)50 μl，滴加DAB工作液顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固。以PBS 代替一抗為陰性對照。利用Nikon 4500顯微鏡攝片，Twist、Snail表達陽性結果為細胞質或胞核染成棕黃色，每張切片隨機選取5個×200倍視野，計數陽性染色細胞數。

1.2.3Western blot分析Twist、Snail蛋白表達 取出低溫保存的胎盤組織，在玻璃勻漿器中，加入1%體積分數的RIPA裂解液進行勻漿，冰水中超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清提取蛋白，應用BCA法進行蛋白質定量，蛋白樣品煮沸變性，SDS - PAGE電泳，分別加入羊抗人Twist 、Snail一抗(均為1 ∶1 500稀釋)，蛋白質濕法轉移至硝酸纖維素膜，生物素化兔抗羊二抗(1 ∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h，ECL化學發光法顯色，Image J凝膠成像分析系統掃描成像，測定目標條帶的光密度值，以β-actin為內參，比較同一胎盤組織目標條帶與β-actin的光密度值，進行半定量分析。

1.2.4EMT檢測和相關性分析 采用免疫組化染色SP法顯示胎盤組織中Vimentin蛋白表達，并與轉錄因子Twist、Snail蛋白表達結果進行相關性分析。免疫組化染色方法和結果判斷與1.2.2步驟相同。組織為前述兩種轉錄因子連續切片的鄰片，觀察并分析各組免疫組化染色切片結果圖像。

2 結果

2.1胎盤組織中Twist、Snail蛋白的表達情況免疫組化SP染色結果顯示，Twist、Snail 陽性染色結果顯示胎盤的絨毛細胞或平滑肌細胞等細胞質或細胞核有棕黃色顆粒沉著，對照組胎盤組織中Twist(圖1A)、Snail(圖2A)表達較弱，胎盤植入組織中Twist、Snail表達明顯增強，且隨著胎盤植入程度的加重，即Twist、Snail表達由胎盤粘連的輕度組(圖1B、2B)到胎盤植入的中度組(圖1C、2C)，再到穿透性胎盤植入重度組(圖1D、2D)呈逐漸增強趨勢。采取南京大學捷達80i軟件計數陽性細胞數，結果見圖3，與對照組陽性染色細胞數比較，胎盤植入組陽性細胞數顯著增多，且隨著胎盤植入程度的加重，增多趨勢有顯著性(P<0.05，P<0.01)。

圖1 胎盤母體面組織中Twist蛋白表達 ×200

2.2Westernblot法檢測Twist、Snail蛋白表達Western blot法檢測各組胎盤組織中Twist、Snail蛋白，與對照組胎盤組織比較，隨著絨毛植入程度的增加，即由輕度胎盤粘連到中度胎盤植入，再到穿透性胎盤植入，胎盤組織中Twist、Snail蛋白灰度呈升高趨勢。灰度比值Image J軟件半定量分析顯示，胎盤植入組胎盤組織中Twist /β-actin、Snail /β-actin顯著高于對照組胎盤組織中Twist /β-actin、Snail /β-actin。見圖4。

圖2 胎盤母體面組織中Snail蛋白表達 ×200

圖3 胎盤母體面組織中Twist、Snail蛋白陽性細胞表達情況

2.3胎盤組織中Vimentin蛋白表達及其與Twist、Snail蛋白表達的相關性免疫組化SP染色結果顯示，Vimentin蛋白陽性染色結果顯示胎盤細胞間質中有棕黃色物質沉著，對照組表達較弱(圖5)，胎盤植入組136例中，102例Twist表達陽性，其中91例Vimentin陽性表達，與Twist蛋白呈正相關性(r=0.180，χ2=7.682，P=0.006)。Snail蛋白Vimentin蛋白表達隨著胎盤植入程度的加重呈逐漸增強趨勢，97例Snail蛋白表達陽性中，有82例Vimentin陽性表達，與Snail蛋白呈正相關性(r=0.154，χ2=5.551，P=0.018)。

圖4 Western blot檢測胎盤組織中Twist、Snail蛋白表達

圖5 胎盤母體面組織中Vimentin蛋白陽性表達 ×200

3 討論

高血壓和產科性出血是孕產婦最為嚴重的不良妊娠，導致嚴重產科性出血的主要因素是胎盤植入[1]。研究[7]顯示，孕產婦胎盤植入是發生嚴重不良妊娠結局的獨立危險因素。胎盤植入是指部分或全部絨毛侵及子宮肌層，根據植入的不同程度，可分為胎盤粘連、胎盤植入和穿透性胎盤植入3種類型；妊娠期間，滋養層細胞增殖、遷移進入絨毛間質中，類似于腫瘤細胞的侵襲性。本組研究和以往研究類似，與正常孕產婦比較，胎盤植入組孕產婦存在年齡增大、妊娠次數和流產次數增多、分娩孕周減小的特點。

轉錄因子Twist具有癌基因作用，在多種惡性腫瘤中高表達，引起腫瘤細胞早期轉移；而轉錄因子Snail 不僅調控腫瘤細胞遷移，而且與腫瘤細胞侵襲性密切相關[8]。在正常孕婦胎盤形成過程中，胎兒的叢密絨毛膜進入母體的基蛻膜，從基蛻膜的毛細血管間隙獲取營養，進行母胎間的物質交換；而胎盤植入孕婦胎盤形成過程中，滋養細胞向子宮平滑肌間結締組織和漿膜下浸潤，細胞間連接作用降低甚至缺失，侵襲能力增強是導致胎盤植入發病的主要因素[9]。本研究通過免疫組化SP法和Western blot實驗均證實，與正常對照組胎盤組織比較，胎盤植入組胎盤組織中Twist、Snail蛋白表達明顯增強，且隨著絨毛植入程度的增加， Twist、Snail蛋白表達呈上升趨勢，表明轉錄因子Twist、Snail參與胎盤植入的發生和發展過程，故兩種蛋白的表達升高可能參與胎盤植入發病。

在惡性腫瘤發展過程中，EMT是指上皮細胞轉化為間充質細胞，表現為細胞表型改變，上皮細胞間黏附功能降低，細胞極性消失，運動和遷移功能上升。誘導EMT 的轉錄因子如Twist 與Snail表達上調，結締組織間充質中表型標志物波形蛋白(Vimentin)表達上調，Vimentin是組成細胞骨架的中間絲蛋白家族成員，表達于各種間充質細胞來源的細胞中，為間充質細胞及其來源腫瘤的特異性標志物[10]。轉錄因子Twist、Snail是EMT中關鍵的調控因子，兩者的表達升高引起細胞間連接作用下降，上皮特性減弱，間充質細胞表型增強，促進EMT 發展，最終細胞遷移侵襲能力增強。本研究采用免疫組化檢測顯示，Vimentin蛋白陽性在正常組表達較弱，而胎盤植入組織表達升高，且有隨著胎盤植入程度的加重而逐漸增強趨勢。采用Spearman相關性分析顯示，胎盤組織中Vimentin陽性表達與Twist蛋白、Snail蛋白呈正相關性，表明Twist、Snail 蛋白表達升高可能會促進EMT轉化，參與胎盤植入發病，抑制Twist、Snail 蛋白表達可能會降低因胎盤植入導致的嚴重不良妊娠結局。