結直腸癌中GLUT-1、HIF-1α表達的臨床意義

武雪亮，王立坤，周海豐，郭 飛，楊永江，劉 博，楊東東，屈 明，薛 軍

據GLOBOCAN 2012統計中國人群結直腸癌目前排位死因順位從第7位上升到第5位，男女死亡率分別為9.0/10萬和6.1/10萬，嚴重威脅國民健康[1]。盡管近年來結直腸癌的普查力度不斷加強、手術方式不斷改進、靶向藥物大力推廣，并取得了一系列的突破，但其5年生存率不足60%，仍是公共衛生的關鍵問題[2]。因此，對結腸直腸癌的深入研究尤對其分子生物學研究具有很高的臨床價值。GLUT-1(glucose transporter,GLUT-1)是葡萄糖轉運蛋白家族中最重要的成員，廣泛存在于真核生物和原核生物中，在腫瘤早期生長，癌癥轉移和侵襲等方面均具有重要作用。相關報道證實，在乳腺癌、食管癌、肝癌等腫瘤細胞內均發現GLUT-1的高表達，GLUT-1的活性和表達水平與腫瘤的惡性生物學行為密切相關[3-5]。目前，GLUT-1在結直腸癌方面的研究鮮有報道，該研究通過對結直腸癌和正常結直腸組織行免疫組織化學染色分析檢測，旨在探討GLUT-1在結直腸癌中的表達情況及與相關臨床病理因素間的關系，為結直腸癌靶向診療提供科學參考。

1 材料與方法

1.1病例資料收集河北北方學院附屬第一醫院普通外科2016年9月～2017年1月手術切除的結直腸癌組織50例和正常結直腸的組織50例，結直腸的癌組織自癌灶中心處取得，另外取經病理證實為正常腸組織的標本切緣。所有病例為原發性腫瘤，術前沒有行針對性治療，如新輔助放化療等，術后標本均在1 h內獲得，并存于液氮中。

1.2主要試劑和實驗方法

1.2.1主要試劑 兔抗GLUT-1多克隆抗體、鼠抗人HIF-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)單克隆抗體購自美國Abeam公司；免疫組化試劑盒、DAB顯色劑購自上海Gene Tech公司。

1.2.2免疫組織化學染色 10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm，應用蘇木精-伊紅染色，行病理診斷。用80 ℃烤箱對切片進行烘烤30 min，再用乙醇進行脫水，并使內源性過氧化物酶滅活，應用枸櫞酸緩沖液行高溫高壓水化修復過程；之后PBS洗3次，加入一抗(1 ∶100)50 μl，溫度控制于4 ℃一夜；再用PBS洗3次，加入二抗50 μl。室溫下DAB顯色，PBS洗3次，蘇木精輕度復染，鹽酸乙醇分化后流動清水沖洗10 min，梯度乙醇脫水，松節油透明和樹膠行封片處理，PBS代替一抗作為陰性對照，光鏡下觀察。

1.2.3陽性結果判定標準[6]GLUT-1陽性染色主要集中于細胞質中，少量表達于細胞核，HIF-1α陽性染色主要集中于細胞核，少量表達于細胞質，均為棕黃色或褐色顆粒，計算陽性細胞百分比并評分，≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%時為2分，51%～75%時為3分，>75%時為4分；同理，無著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，深黃色為3分。然后兩組相乘，0分：-,1～4分：+,5～8分：,9～12分：，陽性包含+～。

1.3統計學處理應用SPSS 17.0軟件進行分析，計數資料以百分率表示，GLUT-1和HIF-1α的表達與臨床病理參數的關系應用χ2檢驗進行分析，采用Pearson法進行相關性分析，檢驗水準設α=0.05。

2 結果

2.1結直腸癌、正常組織中GLUT-1和HIF-1α表達情況癌組和正常組織中GLUT-1陽性表達率分別為68.00%(34/50)、16.00%(8/50)，組間差異有統計學意義(P<0.05)；癌組和正常組織中HIF-1α陽性表達率分別為72.00%(36/50)、20.00%(10/50)，組間差異有統計學意義(P<0.001)，見圖1、表1。

2.2GLUT-1和HIF-1α表達與結直腸癌臨床病理特征的關系GLUT-1和HIF-1α的表達都和腫瘤的浸潤深度、分化程度、TNM分期、淋巴轉移、肝轉移和脈管浸潤有關(P<0.05)。TNM分期高、分化程度越低、伴淋巴結轉移、肝轉移和脈管浸潤的患者GLUT-1和HIF-1α的表達均增強，而GLUT-1和HIF-1α的陽性表達與患者腫瘤大小無相關性(P>0.05)，見表2。

2.3GLUT-1和HIF-1α在結直腸癌中表達的相互關系GLUT-1和HIF-1α在結直腸癌中的表達明顯相關(r=0.508，P<0.001)。GLUT-1在HIF-1α陽性組中的表達(陽性率80.56%)明顯高于在HIF-1α陰性組中的表達(陽性率35.71%)，差異有統計學意義(P<0.001)，見表3。

3 討論

結直腸癌的發生、發展是多個基因調控的多步驟、多因素、多階段的復雜過程，其中失控性生長和不斷侵襲增殖是惡性腫瘤細胞的最主要特征，這種特征的維系主要靠葡萄糖的無氧酵解為其提供能量，該過程即使在氧充足的環境下仍可持續進行[7]。由于腫瘤的高消耗、高代謝，需要較普通細胞成倍的能量。而正常情況下，葡萄糖無法獨立通過細胞膜的雙分子層結構，必須依賴跨膜分布的葡萄糖轉運蛋白作為載體，因而這類載體的活性及表達量對腫瘤細胞的惡性增殖具有極其重要的意義[8]。

GLUT-1是葡萄糖轉運蛋白最重要的成員，GLUT-1內含492個氨基酸，由12個疏水性的跨膜α螺旋結構域、兩個電荷的膜內區及膜外區構成[9]。Deng et al[10]解析的人源GLUT-1的晶體結構顯示其經典的協助轉運超家族的折疊方式：12個跨膜螺旋組成NH2-端和-OOH端2個結構域，其中的腔孔呈向胞內區展開，這即是其轉運的基礎框架。

腫瘤細胞膜上的GLUT-1的表達受多種途徑調節，目前研究較多的有磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑和HIF-1α和p53途徑，PI3K/AKT/mTOR與癌細胞的增殖、微血管形成和轉移蛋白的合成關系密切，且需要大量能量供應，在肝癌、胃癌、子宮癌等腫瘤細胞中均證實能上調GLUT-1的表達[11]。

圖1 結直腸正常組織和癌組織中GLUT-1、HIF-1α蛋白的表達 SP×200 A：GLUT-1；B：HIF-1α；1：正常組織；2：結直腸癌組織

組別nGLUT-1/HIF-1α (n)-+陽性率(%)χ2值P值結直腸癌5016/149/811/1214/1668.00/72.0016.386/14.438<0.001/<0.001正常5042/404/62/32/116.00/20.00

表2 GLUT-1和HIF-1α在結直腸癌組織中的表達及與臨床病理因素的關系[n(%)]

表3 GLUT-1和HIF-1α在結直腸癌組織中表達的相關性(n)

本研究顯示GLUT-1和HIF-1α在正常腸黏膜和腺癌中的表達水平逐步上升，差異有統計學意義，表明在腸黏膜癌變的過程中，細胞膜上的GLUT-1和HIF-1α水平不斷上調，從而確保腫瘤對能量的攝取。進一步研究顯示，GLUT-1和HIF-1α表達水平與結直腸癌的病理分期、浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移、肝轉移和脈管浸潤均明顯相關，且二者存在明顯相關性。HIF-1α是調控癌細胞對低氧耐受的關鍵蛋白，研究[12]表明，在肝癌細胞內，HIF-1α能直接激活GLUT-1等糖酵解相關因子活性，從而滿足肝癌細胞的能量攝取，增強其對低氧的耐受力。在胃腫瘤體外培養的細胞內，低氧條件下應用HIF-1α抑制劑處理后，癌細胞內活性氧比例更高，凋亡更顯著[13]。楊通印 等[14]對142結直腸癌組織標本行免疫組化檢測發現GLUT-1和HIF-1α表達明顯高于正常腸黏膜，且二者存在協同作用，在低氧環境下，HIF-1α表達上調能誘導GLUT-1高表達，加速癌細胞糖酵解，促進癌細胞浸潤和轉移。

綜上，GLUT-1異常表達對結直腸癌的發生和進展有重要作用，深入探究GLUT-1和HIF-1α的作用機制有望為結直腸癌精確治療提供重要的理論依據。