48例原發(fā)性皮膚淀粉樣變病OSMR基因突變檢測(cè)

吳芳芳，呂 萍，薛汝增，梁云生，楊 斌,

原發(fā)性皮膚淀粉樣變病(primary cutaneous amyloidosis, PCA) 是一種淀粉樣物質(zhì)沉積于皮膚組織中而其它器官均無受累的局限性疾病，病理主要表現(xiàn)為淀粉樣物質(zhì)沉積局限于真皮乳頭層，臨床上以典型的皮疹或組織病理活檢及特殊染色來診斷。目前PCA的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是由多種因素相互作用共同導(dǎo)致疾病的發(fā)生，包括遺傳因素、免疫因素、長(zhǎng)期摩擦和日光照射等，但是不同種族人群的易感性及家族聚集現(xiàn)象表明基因因素可能在發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用。目前關(guān)于PCA報(bào)道主要集中在家系患者[1]。該研究對(duì)48例PCA患者(主要是散發(fā)患者)的臨床特點(diǎn)進(jìn)行分析，并對(duì)OSMR基因的2～18號(hào)外顯子進(jìn)行PCR重測(cè)序，探討OSMR基因突變與PCA臨床特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1病例資料

1.1.1病例來源 選取2016年6月～12月于廣東省皮膚病醫(yī)院門診的48例PCA患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：所有入選患者被我院門診醫(yī)師明確診斷，即有典型的皮損且行皮膚組織活檢術(shù)及特殊染色證實(shí)為PCA。

1.1.2年齡和性別 48例PCA患者中，家系患者17例(35.42%)，散發(fā)患者31例(64.58%)。發(fā)病年齡7～79(28.25±9.37)歲。其中，7～20歲11例，21～30歲17例，31～40歲15例，41～50歲5例。其中21～30歲為PCA患者發(fā)病的高發(fā)年齡段。男性患者21例，占43.75%；女性患者27例，占56.25%；男 ∶女為1 ∶1.3。

1.1.3臨床表現(xiàn)及發(fā)病部位 43例患者為苔蘚樣淀粉樣變病,苔蘚型淀粉樣變病是最常見的類型，臨床表現(xiàn)為針頭大小褐色斑疹，漸變?yōu)樯月∑鹎鹫睿|(zhì)硬，表面粗糙，有少許鱗屑(圖1A)；4例患者為斑狀淀粉樣變病，臨床表現(xiàn)為片狀的褐色或紫褐色色素沉著，可融合形成特征性波紋狀(圖1B)；1例患者為皮膚異色病樣淀粉樣變病, 臨床表現(xiàn)為彌漫性網(wǎng)狀色素沉著基礎(chǔ)上點(diǎn)狀白班，無丘疹，皮膚萎縮及毛細(xì)血光擴(kuò)張不明顯(圖1C)。48例PCA患者中有32例患者訴瘙癢，16例患者訴無瘙癢。皮膚瘙癢和丘疹是大部分PCA患者的主要癥狀和體征，組織病理提示表皮角化過度，真皮乳頭層見嗜伊紅均質(zhì)物沉積，散在噬色素細(xì)胞，血管周圍少許淋巴組織，甲基紫染色陽(yáng)性(圖2)。48例PCA患者受累部位如下：37例(77.08%)患者發(fā)生于小腿，該部位是最常見的發(fā)病部位,17例(35.42%)發(fā)生在大腿，27例(56.25%)發(fā)生在前臂，17例(35.42%)發(fā)生在上臂，25例(52.08%)發(fā)生在后背，5例(10.42%)發(fā)生在軀干。其中累及四肢及后背11例(22.92%)。

圖1 皮膚淀粉樣變病患者的臨床表現(xiàn)

A：左下肢脛前見散在丘疹； B：左下肢彌漫性褐色色素沉著呈波紋狀；C：軀干彌漫性色素沉著斑及點(diǎn)狀色素減退斑

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1外周血基因組DNA提取 采集所有患者外周血各5 ml，并采集52例非皮膚淀粉樣變病患者和正常人外周血各5 ml。采用N96血液基因組DNA提出試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，貨號(hào)DP314]提取基因組DNA。

圖2 皮膚淀粉樣變病的組織病理 ×100

A：真皮乳頭層見嗜伊紅均質(zhì)物沉積(HE 染色)；B：甲基紫染色陽(yáng)性

1.2.2OSMR基因全部外顯子的PCR擴(kuò)增 由華大基因公司設(shè)計(jì)特異性引物17對(duì)(表1)。PCR反應(yīng)體系：總體系30 μl，其中上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，Taq PCR Master Mix 9.2 μl,雙蒸水20.8 μl。PCR反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性5 min，96 ℃變性20 s，62～52 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共10個(gè)循環(huán)；96 ℃變性20 s，52 ℃退火30 s，72 ℃總延伸30 s,共35個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸2 min，1個(gè)循環(huán)；溫度降至4 ℃終止反應(yīng)。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物純化及測(cè)序由北京華大基因完成。

表1 OSMR基因2～18外顯子的PCR擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果

2.1OSMR基因突變分析OSMR基因突變類型如下：48例PCA患者中24例患者發(fā)生OSMR基因突變，位于11外顯子及15外顯子。其中12例散發(fā)患者和9例家系患者為G513D點(diǎn)突變，該突變中第1538位堿基呈鳥嘌呤(G)代替了腺嘌呤(A)，使其編碼的甘氨酸(Gly)被天冬氨酸(Asp)取代；1例散發(fā)患者和3例家系患者為P694L點(diǎn)突變，該突變中第2081位堿基呈胞嘧啶(C)代替了胸腺嘧啶(T),使其編碼的脯氨酸(Pro)被亮氨酸(Leu)取代；2例家系患者為K697T點(diǎn)突變，該突變中第2090位堿基呈腺嘌呤(A)代替了胞嘧啶(C)，使其編碼的賴氨酸被蘇氨酸取代(圖3)。同一家系中2個(gè)患者同時(shí)發(fā)生G513D和K697T點(diǎn)突變。OSMR基因其它外顯子及52例非皮膚淀粉樣變病患者和正常人未見突變。

2.2OSMR基因突變與臨床特征之間的關(guān)系24例PCA突變患者中，21例為苔蘚型，3例為斑狀型；有瘙癢和無瘙癢OSMR基因突變率分別為56.25%、37.5%。17例家系患者中發(fā)現(xiàn)12例OSMR基因突變，突變率為70.59%；31例散發(fā)患者中發(fā)現(xiàn)13例OSMR基因突變，突變率為41.94%；家系患者OSMR基因突變率高于散發(fā)患者(χ2=3.989，P=0.046)。不同性別與OSMR基因突變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.116，P=0.146)，有無瘙癢與OSMR基因突變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.500，P=0.221)，不同年齡段與OSMR基因突變采用Fisher精確概率法統(tǒng)計(jì)分析，P雙側(cè)及單側(cè)最小值分別為0.282和0.141，提示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A：OSMR基因G513D正常基因型；B：OSMR基因G513D雜合突變(GGT→GAT)；C：OSMR基因G513D純合突變(GGT→GAT)；D：OSMR基因P694L正常基因型；E：OSMR基因P694L雜合突變(CCG→CTG)；F：OSMR基因K697T正常基因型；G：OSMR基因K697T雜合突變(AAG→ACG)

3 討論

PCA屬于淀粉樣變病的一種，系指淀粉樣蛋白沉積于皮膚組織中而不累及其它器官的一種慢性皮膚病，在東南亞、中國(guó)、中東和南美洲較常見[2]。近年來的研究[1]顯示家系PCA患者的致病基因位于染色體5 p13.1～q11.2，通過候選基因分析，發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變?cè)贠SMR基因和IL31RA基因，這兩個(gè)基因均屬于IL-6家族細(xì)胞因子受體，OSMR編碼的跨膜蛋白OSMRβ是OSMⅡ型受體和IL-31受體的組成部分，IL31RA編碼的IL-31受體α與OSMRβ結(jié)合形成IL-31受體；利用家系PCA患者的皮損培養(yǎng)原代角質(zhì)形成細(xì)胞，OSM細(xì)胞因子刺激后磷酸化的 JAK/STAT、MAPK及PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性降低[3]。散發(fā)PCA發(fā)病率相對(duì)家系PCA較高，但國(guó)內(nèi)外大部分研究者主要研究家系PCA患者的OSMR基因的突變情況，散發(fā)患者OSMR基因突變研究較少，尤其是大陸中國(guó)人的基因突變情況[2-5]。本研究顯示，PCA患者男女比例將近1 ∶1，平均發(fā)病年齡(28.25±9.368)歲，21～30歲為發(fā)病高峰年齡，這與國(guó)外人群的年齡分布類似[6]，但與國(guó)內(nèi)研究[7]相比，本次納入的48例患者的發(fā)病有年輕化趨勢(shì)，這是否和環(huán)境因素改變有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究。本研究表明PCA最常見的類型是苔蘚型，最常見的發(fā)病部位是雙小腿，其次是前臂和后背，這與既往研究報(bào)道相一致。

迄今發(fā)現(xiàn)PCA相關(guān)的OSMR基因突變點(diǎn)共12個(gè)，均為錯(cuò)義變異且主要是家系患者，見表2。本研究中納入一例皮膚異色病樣淀粉樣變病，未檢測(cè)到OSMR基因突變，但可能存在其它位點(diǎn)的基因突變或樣本量少，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究48例患者中，結(jié)果顯示OSMR基因3個(gè)錯(cuò)義突變分別為G513D、P694L、K697T，散發(fā)患者該基因的突變率可達(dá)41.94%，其突變位點(diǎn)位于G513D和P694L，主要集中在G513D位點(diǎn)(38.71%)。G513D位于胞外區(qū)的纖連蛋白Ⅲ-2結(jié)構(gòu)域內(nèi)，P694L、K697T位于胞外區(qū)的纖連蛋白Ⅲ-4結(jié)構(gòu)域內(nèi)，靠近OSMRβ的跨膜區(qū)。可知G513D位點(diǎn)突變既可以是顯性突變也可以是隱性突變，這與以往報(bào)道[5]相一致。通過DNA質(zhì)譜分析法對(duì)360例臺(tái)灣人散發(fā)PCA的基因突變檢測(cè)顯示4個(gè)OSMR基因突變位點(diǎn)分別是V631L、I691T、P694L和K697T[8-12]，該研究在散發(fā)患者中基因突變率較低且未發(fā)現(xiàn)G513D位點(diǎn)的突變。

表2 原發(fā)性皮膚淀粉樣變病OSMR基因突變位點(diǎn)匯總

OSMR基因突變與PCA的發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系目前尚不清楚。有研究[3]指出OSMR基因錯(cuò)義突變導(dǎo)致IL-31的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常。IL-31信號(hào)傳導(dǎo)異常與瘙癢直接相關(guān)[13]。IL-31誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)的分泌，在PCA皮膚中MCP-1表達(dá)降低；對(duì)PCA病理變化的影響可能是缺乏誘導(dǎo)的MCP-1導(dǎo)致在患者皮膚中減少單核細(xì)胞趨化性，從而導(dǎo)致先天免疫功能的改變，清除功能下降和細(xì)胞碎片的積累[14]。表皮神經(jīng)支配增加可能是PCA瘙癢機(jī)制中的一部分；角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡可能激活OSMβ或IL31RA突變，導(dǎo)致下游信號(hào)JAK/STAT、MAPK及PI3K/Akt通路的功能異常[15]。