亮菌口服液對慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜及PDCD4表達的影響

胡 磊，朱耀東，李 平，張 梅

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是一種胃癌前病變，研究證明胃癌前病變患者有著10倍的患癌風險[1]。CAG是胃癌發病模式Correa 級聯反應中較常見病理階段[2]。目前臨床常用防治萎縮性胃炎的措施有質子泵抑制劑、胃黏膜保護劑及幽門螺桿菌根治、內鏡手術等手段[3]。近年中醫藥被廣泛用于防治CAG[4]，為胃癌前病變治療拓展了治療思路。亮菌是我國最初發現并擁有自主知識產權的一種真菌。中醫認為，該菌對胃腸道有保健功能[5]。目前經亮菌發酵提取的亮菌口服液(Armillariella oral solution, AOS)被臨床常用于慢性肝炎、遷延性肝炎、慢性膽管炎和膽囊炎以及慢性胃炎的治療。對AOS前期研究[6-8]顯示，AOS對返流液誘發胃黏膜損傷以及化療引起胃腸道副反應有著改善作用，其機制可能通過調節超氧化物歧化酶(SOD)、白細胞介素-8(IL-8)以及5-羥色胺(5-HT)的活性改變胃腸活動節律。但對治療CAG的作用機制，尚未完全清楚。

程序性細胞死亡因子4(programmed cell death 4, PDCD4)是一種抑癌基因，研究[9]表明該基因通過在胃癌黏膜組織中表達下調及缺失，促進腫瘤增殖。同時既往研究[10]也表明胃癌前病變組織中較正常胃黏膜也存在PDCD4低表達，PDCD4可作為評估胃癌前病變及其轉歸的特異性指標。本研究擬制備CAG大鼠模型，觀測AOS對CAG大鼠胃黏膜腺體萎縮及PDCD4表達的影響，初步探討治療CAG的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑SD雄性大鼠(安徽醫科大學實驗動物中心，Sprague-Dawley)，SPF級，體質量140～180 g，5周齡，共40只。處于室溫24 ℃，濕度50%，通風良好環境中。AOS(合肥誠志生物制藥有限公司，批號為20161109)；胃復春片(杭州胡慶余堂藥業有限公司生產，批號為16066146)，稱取藥物溶于蒸餾水配成0.06 g/ml溶液。胃蛋白酶測試盒(南京建成生物工程研究所，批號為20170503)；兔抗大鼠PDCD4多克隆抗體(美國Proteintech公司，批號12587-1-AP)； N-甲基-N硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)(山東西亞化學工業有限公司，批號為Q94510)；小鼠/兔聚合物法檢測系統(北京中衫金橋生物技術有限公司，批號17G37D07)；10%水合氯醛(安徽省立醫院，批號20170706)。

1.2儀器DHG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海齊欣科學儀器有限公司)；GFL1008型水浴鍋(深圳市朗誠科技股份有限公司)；SPX-250-2型生化培養箱(上海赫田科學儀器有限公司)；Thermo Muitioken MK3型酶標儀(瑞士TECAN公司)；5424R型高速冷凍離心機(德國艾本德公司)；BX53型光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；RM2235型切片機(德國萊克公司)。

1.3方法所有SD鼠隨機分為對照組10只，模型制備組30只；對照組自由飲食水，模型制備組自由飲用100 μg/ml MNNG聯合饑飽失常(飽食2 d，饑餓1 d)9周[11]；隨機從兩組各取2只SD鼠頸椎脫臼法處死，通過肉眼及HE染色鏡下觀察模型制備情況。模型成功標準：肉眼可見胃黏膜缺損，黏膜層變薄，胃黏膜由正常的橘紅色變為紅白相間，黏膜下血管透見；鏡下觀可見胃黏膜腺體數目減少，細胞核固縮且深染，腸上皮化生出現。模型制備過程中2只SD鼠死亡, 從制備組剩余26只鼠中隨機取25只，依次分為模型組、AOS低劑量組、中劑量組、高劑量組、胃復春組，每組各5只。從對照組8只鼠中隨機取5只為正常組。其中正常組及模型組用生理鹽水灌胃，劑量為10 ml/kg；AOS低劑量組、中劑量組、高劑量組用亮菌口服液灌胃，劑量依次為0.5、1.0、2.0 ml/kg ；胃復春組用胃復春灌胃，劑量為10.0 ml/kg。干預期間以上6組正常飲食水，每天灌胃1次，療程28 d。

1.4檢測

1.4.1大鼠一般情況觀察 觀察大鼠情緒、毛發顏色及外觀、飲食、體質量及眼睛的變化，觀察大鼠刺激后的反應能力，呼吸的頻率、節律，大便是否帶血、黏液等。

1.4.2胃液pH、分泌量及胃蛋白酶效價測定[12]灌藥28 d后，10%水合氯醛 (0.03 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取頭高腳低仰臥位幽門部下端約5 mm處結扎。靜置4 h，收集胃液。胃液于4 000 r/min離心15 min， 吸上清液于2.0 ml EP管，13 000 r/min離心10 min，吸取上清液。計胃液總量并用精密pH試紙測胃液pH值，依據ELISA試劑盒步驟測胃蛋白酶效價。

1.4.3胃組織形態肉眼及鏡下觀察 取胃液后，距賁門部5 mm處切斷，從整個胃部取部分胃體，沿胃小彎切開，緩慢沖洗干凈，肉眼觀察胃體形態后，4%中性福爾馬林浸沒2 d后剪取約15 mm×8 mm長條狀組織。胃組織常規HE染色鏡下觀察胃病理結構。

1.4.4免疫組化測PDCD4蛋白表達 按照免疫組化SP法，依次脫蠟脫水，檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)抗原修復，過氧化物酶阻斷劑溫育10 min，洗滌，PDCD4兔抗大鼠多克隆一抗(1 ∶300)，HRP標記的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物二抗，DAB顯色4 min，復染細胞核，脫水、封片。結果判斷以光鏡下觀察視野中呈棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，視野中染色程度分級：無染色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。每張載玻切片隨機選取6個視野光鏡觀察，以陽性細胞占視野比例分級：無陽性細胞0分，<25%為1分，25%～75%為2分，>75%為3分。計視野染色程度分級及陽性細胞占視野比例分級數值的乘積為總分進行分析比較(總分=PDCD4表達陽性細胞比例分級×染色程度)。

2 結果

2.1大鼠一般情況對照組大鼠情緒穩定，刺激后反應靈敏，動作靈活，呼吸規律，毛發細膩光澤，眼睛紅潤，大便正常。模型制備早期大鼠躁動與淡漠情緒交替，刺激后反應遲鈍，呼吸稍急促，毛發暗黃粗糙，眼睛黯淡，活動少，食少；模型制備后期大鼠情緒淡漠，幾乎不活動，常蜷曲伴顫抖，乍毛，大便灰褐色稀稠樣。經藥物干預后，與模型組比較，AOS中劑量組、高劑量組與胃復春組明顯好轉；較正常組毛發顏色稍有差異，其他無明顯差異。但AOS低劑量組大鼠反應仍遲鈍，活動及食量介入正常組與模型組之間，呼吸稍急促。藥物干預期間未發生大鼠死亡。各組體質量變化見表1。

表1 治療期間各組大鼠體質量變化比較

與模型組比較：*P<0.05；與正常組比較：##P<0.01

2.2胃液pH、分泌量及胃蛋白酶效價各組結果比較28 d后，與正常組比較，模型組大鼠胃液pH值升高(P<0.01)，胃液分泌量及胃蛋白酶效價明顯減少(P<0.01)。與模型組比較，AOS中劑量組、高劑量組及胃復春組胃液pH值降低(P<0.01)，胃液分泌量增加及胃蛋白酶效價增多(P<0.05)。見表2。

2.3病理形態變化

2.3.1肉眼觀察 正常組胃黏膜層表面完整、光滑、無出血點，呈肉紅色；皺襞完整凸起、無序交錯、厚薄均一、皺襞表面有適量透明黏液。與正常組比較，模型組黏膜層表面粗糙呈細顆粒狀、少量出血點，色澤紅白相間；皺襞明顯變淺、皺襞間交錯不連續、厚薄不均一；部分皺襞變淺，甚至消失；黏膜層厚度薄、表面黏液量少、黏膜下血管透見。與模型組比較，AOS中劑量組、高劑量組及胃復春組胃表面較完整、出血點極少、色澤淡紅色；皺襞多見，其表面有大量黏液附著。AOS低劑量組胃黏膜層厚薄不均一；黏膜表面仍有粗糙且少許出血點，局部色澤紅白相間。見圖1。

2.3.2鏡下觀察 正常組胃體部腺體排列整齊、 腺體大小一致；黏膜層厚度及胃小凹深度適中；固有層偶見少量炎性細胞；細胞間界限清晰，細胞核正常，核漿比正常。模型組胃腺體縮小且腺管排列紊亂扭曲，腺體減少；黏膜層變薄且腸上皮化生，胃小凹變淺；黏膜層及固有層有大量炎性細胞、散在分布；細胞核深染固縮，核漿比例失調。與模型組比較，AOS中劑量組、高劑量組及胃復春組腺體排列及大小明顯改善，細胞核漿比基本正常；腸型腺上皮與炎性細胞減少。但AOS低劑量組改善不明顯，腺管排列仍紊亂，細胞核漿比有異常。見圖2。

2.4免疫組化測胃組織PDCD4蛋白表達胃組織中有PDCD4蛋白表達呈棕色，無PDCD4蛋白表達呈藍色。與正常組比較，模型組PDCD4表達量明顯下調(P<0.01)。與模型組比較，AOS中劑量組、高劑量組PDCD4蛋白表達量上調(P<0.05)；同時AOS高劑量組及胃復春組表達多于低劑量組及中劑量組。見表2、圖3。

表2 治療后各組大鼠胃液pH值、分泌量、胃蛋白酶效價及胃黏膜組織PDCD4表達比較

與正常組比較：##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01

圖1 AOS對大鼠胃黏膜大體形態的影響A：正常組；B：模型組；C：AOS低劑量組；D：AOS中劑量組；E：AOS高劑量組；F：胃復春組

圖2 AOS對大鼠胃組織病理變化的影響 HE染色×200A：正常組；B：模型組；C：AOS低劑量組；D：AOS中劑量組；E：AOS高劑量組；F：胃復春組

圖3 AOS對CAG大鼠PDCD4表達的影響 免疫組化×400A：正常組；B：模型組；C：AOS低劑量組；D：AOS中劑量組；E：AOS高劑量組；F：胃復春組

3 討論

慢性萎縮性胃炎作為胃癌前病變的一種，是目前的治療熱點，不斷探索最有效治療手段緩解CAG消化道癥狀及改善生活質量。亮菌口服液在臨床上用于慢性萎縮性胃炎患者治療有著顯著的療效，但其長期缺乏基礎研究及作用機制不明。本研究制備CAG大鼠模型，觀察AOS對胃液pH值、分泌量、胃蛋白酶效價、胃黏膜腺體萎縮及PDCD4蛋白表達的影響。CAG胃黏膜病變過程中黏膜腺體萎縮，甚至消失，表面黏液層逐漸減少。正常胃黏膜表面由黏液及碳酸氫鹽形成約0.5 mm凝膠黏液屏障保護層，具有緩解食物機械性損傷、細菌生物損害及H+化學侵蝕作用。而黏液及碳酸氫鹽由胃黏膜層分泌，其中隨著黏膜萎縮加重，分泌細胞減少，從而直接影響鹽酸、胃蛋白酶原不同程度的缺乏，進一步干擾胃部消化、殺菌、營養等功能。因此，本研究通過胃液pH值、分泌量、胃蛋白酶效價間接反映AOS治療后CAG大鼠病理轉歸，同時經肉眼及鏡下直接觀察AOS可抑制黏膜萎縮。

研究[13]發現PDCD4在人類胃癌組織存在下調，萎縮性胃炎黏膜中PDCD4也低表達。PDCD4基因低表達可能與miRNA的3′-UTR位點被干擾影響基因轉錄調控有關。胃癌組織中miR-208a-3p表現尤為突出，隨著表達增加PDCD4基因表達下調，促進胃組織細胞增殖加快及細胞核的特定變化[14-15]。本研究證實CAG PDCD4基因蛋白表達少，隨著AOS抑制CAG胃黏膜萎縮后PDCD4基因蛋白表達增多。因此，CAG的轉歸機制可能與PDCD4基因表達有關。通過對PDCD4研究，探討與CAG病情轉歸的相關性，可通過對結合其他相關基因多靶點監測判斷AOS改善CAG治療療效有著一定臨床意義。也對AOS的深入研究，探討其更多的作用機制及臨床適應癥提供堅實的基礎依據。