ANXA2-siRNA轉染對胃癌耐藥細胞藥物敏感性的影響及機制

余南榮，曾 祥，徐厚巍，藍俊松

胃癌是消化系統中最常見的惡性腫瘤之一，隨著社會的發展，胃癌的發病率呈現逐年升高的趨勢，甚至有年輕化的傾向[1]。目前在臨床上，針對胃癌主要的治療手段是手術治療為主的綜合治療，化療能夠在一定程度上縮小腫瘤體積、減慢胃癌的發展速度，為患者爭取更多的手術機會。但胃癌是各類惡性腫瘤中化療敏感性較差的種類之一，對化療藥物的多藥耐藥是引起化療效果差的主要原因[2]。近年來針對胃癌耐藥性的研究[3]顯示，膜聯蛋白A2基因(Annexin A2，ANXA2)在胃癌細胞中顯現出異常表達，推測其有可能與胃癌的耐藥有關。該研究對胃癌細胞進行ANXA2-siRNA轉染，觀察胃癌耐藥細胞的藥物敏感性變化以及細胞中信號通路激活狀態的變化情況。

1 材料與方法

1.1主要實驗材料順鉑(DDP)購自山東德州制藥廠；MTT試劑盒購自美國Solarbio公司；Bcl2多克隆抗體、AKT多克隆抗體、p-AKT(磷酸化-ANKT)多克隆抗體、P38多克隆抗體以及p-P38多克隆抗體、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均購自Santa Cruz公司；ANXA2-siRNA及PCR引物合成自上海生物工程有限公司；SGC-7901/DDP耐藥細胞購自南京凱基生物技術有限公司；RNApure超純總RNA快速提取試劑盒購自北京Biomed公司；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒購自北京TransGen Biotech公司。3131型CO2細胞培養箱購自美國Thermo公司；凝膠成像儀UV-254購自美國基因公司；紫外分光光度計購自美國Bio-Rad Headquarters；電泳儀、垂直電泳槽等購自北京六一儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 SGC-7901/DDP耐藥細胞接種于含有培養基的培養皿中，培養基配比為RPMI1640培養液中加入10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和鏈霉素。當細胞生長至90%～100%融合時，吸去培養液后用PBS清洗3遍后加入0.25%的胰蛋白酶充分消化，使細胞脫離培養皿，丟棄消化液后加入培養基終止消化，反復吹打形成細胞懸液后進行傳代。選擇無污染處于對數生長期的細胞用于實驗。根據處理方法，將細胞分為三組：空白對照組、空白-siRNA組、ANXA2-siRNA組。

1.2.2細胞轉染 轉染前將細胞培養基置換成不含胎牛血清和抗生素的RPMI1640培養液。將siRNA加入至250 μl不含胎牛血清和抗生素的RPMI1640培養液中，將10 μl陽離子脂質體Lipofectamine 2000TM加入另一250 μl不含胎牛血清和抗生素的RPMI1640培養液中靜置5 min后將兩者混合，室溫下放置20 min后加入至各組細胞的培養基中，6 h后再次更換培養液。

1.2.3細胞總RNA提取及RT-PCR 采用TRIzol一步法提取細胞總RNA，按1 ml/10 cm2培養皿貼壁細胞加入TRIzol，裂解液經氯仿抽提(每1 ml TRIzol 加0.2 ml)后，用RNApure超純總RNA快速提取試劑盒提取細胞總RNA。利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，將總RNA逆轉錄為cDNA。過程如下：取5.0 μg總RNA，加入1 μl Oligo(dT)，2×ES reaction mix 10 μl，esayscriptRT/RI enzyme mix 1 μl,補無核糖核酸酶游離水至20 μl，42 ℃孵育30 min，然后85 ℃ 5 min失活easyscript RT。分裝后-20 ℃保存。β-actin、GST、Bax反應體系如下：Mix 10 μl，上游引物0.5 μl，下游引物 0.5 μl，cDNA 1 μl，補ddH2O至20 μl。然后95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠鑒定。引物序列參見表1。重復10次，然后采用Image J軟件進行灰度分析。

表1 引物序列

1.2.4細胞蛋白提取及Western blot分析 在各組直徑100 mm平皿中，在生長良好的貼壁培養細胞中加入200～300 μl 85 ℃的1×SDS凝膠加樣緩沖液(50 mmol/L Tris-Cl，pH 6.8；100 mmol/L DTT；2%SDS；10%甘油；0.1%溴酚藍)裂解細胞；裂解樣品經煮沸、超聲、離心后，取上清液，紫外光譜檢測定量，-20 ℃分裝保存。將50 μg樣品加入1×SDS凝膠加樣緩沖液，100 ℃變性10 min，順序加樣，行12%的SDS-PAGE電泳。電泳結束后，經濕式電轉儀(Bio-Rad)恒流冰浴轉膜，5%脫脂牛奶4 ℃封閉1 h；分別孵育一抗后，在4 ℃過夜。加入羊抗鼠或羊抗兔二抗孵育1 h，化學發光、顯影、定影。觀察雜交信號。重復10次，采用Image J軟件進行灰度分析。

1.2.5MTT分析 將各組對數生長期的細胞消化制作成細胞懸液計數后，按照1×104個/孔的數量將200 μl細胞接種于96孔板內，每組設6個平行孔，培養24 h后，將培養孔內的培養基更換為含有不同濃度DDP(0、2、4、8、10 μg/L)、5-氟尿嘧啶(5-FU)(0、2、4、8、10 μg/L)的培養基，再培養48 h后，每個培養孔內加入20 μl MTT繼續培養4 h后棄上清液，每孔加入150 μl DMSO后室溫下水平震蕩10 min后采用酶標儀測定490 nm處每孔的吸光度，取平均值，測定每組細胞的半數抑制濃度(IC50)值。

2 結果

2.1胃癌耐藥細胞耐藥相關基因表達ANXA2-siRNA轉染SGC7901/DDP細胞后，無論在RNA水平還是蛋白水平上，耐藥相關基因GST的表達水平顯著降低，而Bax的表達水平明顯上調，見圖1、2和表2、3。

圖1 GST、Bax在RNA水平的表達變化

圖2 GST、Bax在蛋白水平的表達變化

項目空白對照空白-siRNAANXA2-siRNAF值P值GST灰度201.16±8.98202.98±7.4791.98±7.247.560.000Bax灰度133.63±6.16132.03±5.74153.98±9.6714.820.001

表3 GST、Bax在蛋白水平的表達變化的灰度分析

表4 MTT藥敏實驗結果

表5 MAPK及PI3K/Akt信號通路激活變化的灰度分析

2.2MTT藥敏實驗與空白對照組和空白-siRNA組細胞相比，ANXA2-siRNA轉染SGC7901/DDP細胞對化療藥物DDP和5-FU的IC50值顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

2.3ANXA2-siRNA轉染對MAPK及PI3K/Akt信號通路激活的影響與空白對照組和空白-siRNA組細胞相比，ANXA2-siRNA轉染SGC7901/DDP細胞后，MAPK信號通路中，P38表達無明顯變化，但P38磷酸化水平下降明顯。在PI3K/Akt信號通路中，AKT表達無明顯變化，但AKT磷酸化水平下降明顯。見圖3、表5。

圖3 MAPK及PI3K/Akt信號通路激活變化

3 討論

3.1ANXA2-siRNA轉染對胃癌耐藥細胞藥物敏感性的影響胃癌的發病率高，但早期診斷率低，患者就診時往往已處于進展期胃癌，失去了手術機會，化療成為主要的治療手段。但胃癌細胞在化療過程中對化療藥物的敏感性不同，甚至會產生耐藥性，導致化療的效果不佳[4]。胃癌耐藥細胞的出現是胃癌化療中棘手的問題之一。促進胃癌耐藥細胞對化療藥物的敏感性，降低耐藥性，是目前研究的熱點。

胃癌的耐藥機制目前仍不明確，可能涉及多種耐藥基因如P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽轉移酶(GST)、拓撲異構酶Ⅱ(Topo-Ⅱ)等[5-7]。GST在生理狀態下能夠通過催化藥物與谷胱甘肽的結合，參與藥物的代謝，主要有堿性、中性、酸性三種類型。其中酸性GST在多種耐藥腫瘤細胞中表達異常[8]。目前認為GST能夠使結合到谷胱甘肽上的化療藥物增加，從而使藥物外流減少而降低了細胞毒性，在鉑類、蒽環類藥物的耐藥性產生中發揮重要作用[9]。Bax是Bcl-2家族中主要的促細胞凋亡蛋白。細胞凋亡信號激活Bax后，Bax從細胞質轉移到線粒體膜上，使線粒體滲透性變化，影響細胞氧化還原作用，從而促進細胞的凋亡[10]。本研究ANXA2-siRNA轉染胃癌耐藥細胞后顯示，耐藥基因GST的表達量明顯下降，而促細胞凋亡基因Bax表達量升高，這說明胃癌細胞的耐藥性發生改變。進一步采用MTT藥敏實驗法分析胃癌耐藥細胞對一線化療藥物DDP和5-FU的敏感性，結果顯示ANXA2-siRNA轉染后，半數致死量藥物濃度明顯下降，細胞對DDP和5-FU的敏感性顯著升高。有可能ANXA2-siRNA轉染后，更多的化療藥物進入胃癌細胞內，從而提高了藥物的殺傷能力。

本研究結果結合其他相關研究，推測ANXA2與胃癌的耐藥性具有密切的關系，降低胃癌耐藥細胞中ANXA2的表達，能夠改善胃癌耐藥的現狀。ANXA2與胃癌的關系密切，多項研究[11-12]已經證實ANXA2在胃癌組織中異常高表達，甚至在胃癌的腫瘤分化、轉移浸潤中也起到重要作用。也許將ANXA2作為解決胃癌耐藥性問題的切入點能夠取得突破性進展。

3.2ANXA2-siRNA轉染對胃癌耐藥細胞信號通路激活的影響細胞內存在多種信號通路，參與細胞的增殖、分化、凋亡等多種生理病理過程。ANXA2是一種膜聯蛋白，能夠與多種不同的磷脂蛋白結合，參與多個信號通路的激活或抑制，從而調節細胞的生長和凋亡。在鼻咽癌的研究中顯示ANXA2能夠調控上皮間充質細胞的轉化，如果靶向下調ANXA2的表達能夠降低鼻咽癌的發生和對化療藥物的耐藥性[13]。如前所述，在本研究中轉染ANXA2-siRNA，下調胃癌耐藥細胞的ANXA2表達后，胃癌耐藥細胞中的耐藥相關基因表達量明顯下降，促凋亡基因表達量明顯升高，胃癌耐藥細胞對化療藥物的敏感性大大提高。

本研究將MAPK及PI3K/Akt信號通路作為研究點，以探討ANXA2影響胃癌細胞耐藥的機制。MAPK信號通路是絲裂原活化蛋白激酶通路，主要起到將細胞外信號轉移至細胞核的作用，在信號通路中，多種蛋白激酶發生磷酸化而發揮信號傳導的作用，其中P38及其磷酸化是非常關鍵的步驟[14]。PI3K/Akt信號通路在胃癌的發生、治療中起著橋梁的連接作用，PI3K在一系列上游信號的作用下，通過AKT等多種下游信號分子調節細胞的凋亡、對藥物的敏感性等[15]。將胃癌耐藥細胞SGC7901/DDP進行ANXA2-siRNA轉染后，MAPK信號通路中雖然P38表達量無變化，但磷酸化的P38水平明顯下降。同樣在PI3K/Akt信號通路中，雖然AKT表達量無明顯變化，但磷酸化的AKT表達明顯下調，這說明ANXA2-siRNA轉染后對MAPK及PI3K/Akt信號通路的激活具有一定的影響。因此，ANXA2可能通過MAPK及PI3K/Akt信號通路改變胃癌耐藥細胞的化療藥物敏感性。

綜上，ANXA2-siRNA轉染胃癌耐藥細胞能夠下調胃癌耐藥相關基因的表達，降低胃癌細胞的耐藥性，其機制可能是通過影響MAPK及PI3K/Akt信號通路中P38和AKT磷酸化過程實現的。