TK1與腫瘤標志物在消化道腫瘤診斷及病理學特征的相關性

江蓓蕾，鮑揚漪，葉 艷

癌癥是當今全球嚴重威脅人類身心健康乃至生命的一種以細胞增殖異常為主要表現的疾病。在過去數十年里腫瘤標志物(tumor marker，TM)一直是腫瘤研究的熱點之一。胸苷激酶1(thymidine kinase 1，TK1)是與細胞DNA增殖、合成關系密切的酶，健康人血清中與和非增殖狀態下的細胞中含量極低，然而隨著惡性腫瘤細胞的快速繁殖，TK1水平會隨之同步升高[1]，與全身臟器腫瘤的發生發展及其預后的關系也逐漸受到關注。TK1是嘧啶補救合成途徑的關鍵酶之一，因此可作為一種與腫瘤細胞增殖相關密切的TM。已有大量的研究[2]探討消化道腫瘤患者TK1與糖類抗原199(carbohydrate antigen 19-9，CA199)、癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)等TM的血清水平，結果顯示腫瘤患者的TK1水平明顯高于正常人，在消化道腫瘤的診斷、鑒別診斷、療效監測和預后評估中有著一定的應用前景。該研究擬進一步探討血清TK1、CA199及CEA 水平在消化道腫瘤診斷及與其嚴重程度的相關性，為今后TK1更精準地用于消化道腫瘤診療提供依據。

1 材料與方法

1.1病例資料選取合肥市第一人民醫院集團醫院2015年11月～2017年11月胃癌與結直腸癌147例次病例。所有患者均經影像學、胃鏡、腸鏡、手術及術后病理確診，術前均未經其他治療。其中胃癌76例(男56例，女20例，年齡40～87歲，中位年齡69歲)，結直腸癌71例(男50例，女21例，年齡32～82歲，中位年齡64歲)。選取70例健康體檢者作為對照組(男38例，女32例，年齡22～71歲，中位年齡52歲)，所有患者及健康體檢者得到本人或其家屬的知情同意，并報我院倫理委員會批準。

1.2病理學特征取胃癌與結直腸癌的黏膜組織(一般厚度不超過0.5 cm)投入預先配好的固定液中(10%福爾馬林、Bouin氏固定液等)使組織細胞的蛋白質變性凝固。按照以下步驟進行HE染色：組織固定成功后需要修剪25 px*25 px*5 px，放入包埋盒中，流水沖洗(去除組織中的固定液)30 min。至于不同濃度的酒精脫水，一般用由低濃度到高濃度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水分。再將組織塊置于既溶于酒精，又溶于石蠟的透明劑二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊中的酒精，才能浸蠟包埋。將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進行包埋，冷卻凝固成塊即成。包埋好的組織塊變硬，才能在切片機上切成很薄的切片。將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成薄片，一般為5～8 μm厚。切下的薄片往往皺折，要放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放45 ℃恒溫箱中烘干，進行HE染色。在鏡下分析記錄胃癌、結直腸癌的分化程度、浸潤深度、腫瘤直徑、腫瘤位置、淋巴結轉移等病理學指標。

1.3TM檢測

1.3.1TK1檢測 標本收集: 空腹采集消化道腫瘤患者接受治療前靜脈血2 ml，分別用生化管收集血液，室溫待血液凝固，離心分離血清進行TK1檢測，方法：3 000～4 000 r/min離心5～10 min，取100～200 μl血清分裝于兩個潔凈的EP管中并編號(一管用于檢測、另一管用于復檢)，保存在-20 ℃以下待檢。檢測步驟:根據試劑盒說明書配制pH為7.6抗體稀釋液，洗液和封閉劑；根據檢測人數選擇24或48的硝酸纖維素膜模板，不同濃度的校準品按1號、2號、3號的順序，點樣到A1、A2、A3位置上，待檢樣品按順序點在膜上，室溫自然晾干20～30 min；在反應盒內用封閉液封閉30 min；加入一抗，25 ℃孵育2 h；用洗滌液漂洗3次，5 min/次；再加生物素化二抗后室溫下孵育40 min，洗滌液漂洗3次，5 min/次；按1 ∶10 000稀釋鏈酶親核素-酶復合物室溫孵育1 h，洗滌液漂洗3次，5 min/次；加入ECL發光劑，過膜浸濕并精確反應1 min，將膜片用吸水紙吸干，然后放入塑料膜內擠干剩余的溶液；將膜放入CIS2 I型化學發光成像分析系統內進行分析檢測,步驟按照試劑盒說明書執行。

1.3.2CEA、CA125檢測 空腹采集消化道腫瘤患者接受治療前靜脈血2 ml，室溫自然凝固后，以3 500 r/min離心4 min，分離上清液。采用化學發光免疫分析法檢測血清CEA、CA125水平。全自動免疫分析儀(Dxi800)、配套檢測試劑盒-癌胚抗原測定試劑盒(化學發光法)、CA199定量檢測試劑盒(化學發光法)均購自美國貝克曼公司。

1.4TNM分期TNM分別代表腫瘤浸潤胃壁深度、淋巴結轉移及遠處轉移(采用AJCC擬定的胃癌TNM分級與分期系統)。T1：腫瘤浸及黏膜或黏膜下層，T2：腫瘤浸潤至肌層或漿膜下，T3：腫瘤穿透漿膜層，但未侵及鄰近器官，T4：腫瘤穿透漿膜層，侵及鄰近器官。將N0定為無淋巴結轉移，N1定為淋巴結轉移數目在1～6個，N2轉移數為7～15個，N3為16個以上的轉移淋巴結，肝十二指腸韌帶、胰后、腸系膜和腹主動脈旁遠處淋巴結轉移。M0：無遠處轉移；M1：有遠處轉移。TNM分期中T、N、M確定后就可以得出相應的總的分期，即I期、II期、III期、IV期等。

1.5統計學處理采用SPSS 19.0軟件進行分析，數據為計量數據，組內比較采用單因素方差分析(One way Anova)進行檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。繪制ROC曲線并計算曲線下面積(area under curve，AUC)。

2 結果

2.1胃癌與結直腸癌腫瘤標志物水平及診斷效能比較各腫瘤標志物組內比較，差異有統計學意義(P<0.01)。結直腸癌CEA、CA199水平與胃癌相比，差異無統計學意義(P>0.05)，胃癌患者TK1水平明顯低于結直腸癌患者,差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。TK1分別與CEA、CA199聯合檢測以及CEA和 CA199聯合檢測結果顯示，聯合檢測ROC的 AUC均大于0.7，其中三項指標聯合準確性最高，其次是TK1和CA199聯合，再次是CEA和CA199聯合，最差為TK1與CEA聯合。見圖1、表2。

表1 胃癌與結直腸癌腫瘤標志物水平比較

與胃癌患者比較：*P<0.05；與結直腸癌患者比較：#P<0.05

圖1 聯合檢查指標血清水平的ROC曲線

表2 TK1、CEA、CA199 聯合檢測的敏感度、特異度及AUC

2.2不同病理特征胃癌患者的TM水平比較胃癌患者有淋巴結轉移、浸潤深度深、腫瘤直徑大、胃上部及低分化胃癌患者CEA、CA199及TK1水平均明顯高于無淋巴結轉移、浸潤深度淺、腫瘤直徑小、胃中下部及高分化(P<0.01)。見表3。

表3 不同病理特征胃癌患者的腫瘤標志物水平比較

與漿膜層、<2 cm、胃上部及低分化比較：*P<0.05；與肌層、2～4 cm及胃中部比較：#P<0.05

2.3不同病理特征結直腸癌患者的TM水平比較不同發病部位的結直腸癌患者三指標水平差異無統計學意義(P>0.05)。其他特征包括浸潤深度越大、存在淋巴結轉移、管腺癌、腫瘤直徑>5 cm及低分化病例，CEA、CA199及TK1水平均明顯高于結直腸癌浸潤深度淺、無淋巴結轉移、粘液腺癌、腫瘤直徑≤5 cm及高分化病例(P<0.01)。見表4。

表4 不同病理特征結直腸癌患者腫瘤標志物水平比較

與漿膜層及低分化比較：*P<0.05；與肌層比較：#P<0.05

2.4胃癌與結直腸癌TM與TNM分期的相關性胃癌及結直腸癌患者各腫瘤標志物均隨分期的增加而增加，其中胃癌患者TK1水平隨TNM分期遞增，差異有統計學意義(P<0.05)；結腸癌患者CEA、TK1隨TNM分期遞增，差異有統計學意義(P<0.05)，同時各分期組間TK1水平差異亦有統計學意義(P<0.05)。見表5。

3 討論

基因型的標志物異常主要見于癌變前階段或腫瘤早期，可作為腫瘤易感性和早期篩查的工具。至今TM仍未有統一的分類規范，TM檢測的主要意義仍是：腫瘤篩查、輔助診斷、療效觀察和預后判斷[3-5]。

表5 胃癌與結直腸癌TM與TNM分期的相關性

與胃癌、結直腸癌I期比較：*P<0.05；與胃癌、結直腸癌Ⅱ期比較：#P<0.05；與胃癌、結直腸癌Ⅲ期比較：△P<0.05

TK1屬于催化胸腺嘧啶核苷轉化為單磷酸胸腺嘧啶的重要酶，其含量和腫瘤DNA的合成呈正相關性[6]。健康成人血清及組織TK1水平極低，而惡性腫瘤患者，TK1水平隨腫瘤細胞增殖速度而升高，超出正常人群水平的2～100倍，TKl水平升高和腫瘤細胞增殖狀態關系密切。因此血清學TK1水平的檢測可作為動態觀察體內腫瘤細胞增殖的指標。Zou et al[7]提出TK1可作為一種潛在的TM用于胃癌等消化道癌癥的術后評估。Huang et al[8]對 8 135例受試者進行血清TK1檢測，89.2%的血清TKl水平升高人群存在癌前病變或早期癌癥的風險，因此TK1可作為可靠的篩查指標。Xu et al[9]對1 068人次的多分組研究表明血清 TK1 能夠作為較好的診斷惡性腫瘤的指標。Chen et al[10]對1 247例臨床癌癥患者進行研究，結果顯示TK1水平與臨床分期關系密切，可用于療效預測。目前研究多聚焦在TK1在腫瘤的早期診斷及臨床分期的應用，TK1聯合檢測及病理分期在消化道腫瘤的研究方面甚少。本研究通過檢測胃癌和結腸癌患者外周血TK-1水平，結果顯示：胃癌患者血清中TK1水平與其發病部位相關，以胃上部及低分化胃癌患者TK1水平升高較為明顯，而且其水平也與胃癌病理學特征-轉移、浸潤及瘤體大小相關，差異有統計學意義；結直腸癌患者血清中TK1水平與其結直腸癌病理學特征-轉移、浸潤及瘤體大小等標志水平相關，差異有統計學意義；胃癌患者中TK1表達水平明顯低于結直腸癌患者。本研究所納入病理特征體現了腫瘤的侵襲性，一定程度提示TK1不僅與腫瘤細胞增殖相關，也與腫瘤侵襲性相關。

本研究還比較了TK1、CEA、CA199三聯和CEA、CA199二聯的檢測數據，發現TK1、CEA、CA199三聯準確性更高。胃癌患者TK1水平隨著TNM分期的遞增而升高，且結直腸癌患者伴隨分期的遞增較胃癌更為顯著。本研究納入例數有限，側面反映了TK1無論在惡性病變的聯合診斷還是在嚴重程度評估中均具有顯著優勢。

1965年Gold et al[11]首次發現了CEA。CEA水平的明顯增高主要見于74%的結腸癌、90%的胰腺癌患者。CA199也在消化系統多數腫瘤中作為標志物之一，正常人血清含量極微；患有肝膽、胰腺癌和胃腸道腫瘤時患者血中的CA199水平可顯著升高，其中胰腺癌陽性率為85%～95%,膽管癌和膽囊癌為85%左右,直腸癌為30%～50%[12-13]。因此，CA199可作為胰腺癌和消化道癌癥的主要篩查指標。本研究結果顯示胃癌患者CEA及CA199水平的表達也與胃癌病理學特征-轉移、浸潤及瘤體大小呈正相關性。

綜上所述,CEA、CA199及TK1水平均與胃癌及結直腸癌的發病、病理特征及TNM分期有著密切關系，三者聯合可有效提高消化道腫瘤的診斷效能，血清水平越高，病理特征惡性程度越高，TNM分期更高。胃癌患者TK1表達水平高于結直腸癌患者，TK1水平在消化道腫瘤之間也存在一定差異，TK1用于消化道腫瘤篩查時，可幫助醫師初步判斷病變位置以便有針對性地進行進一步檢查，TK1水平與TNM分期更為密切，因此TK1在消化道腫瘤診斷及嚴重程度判斷中更有前景。