染料木素對HT29細胞IL-8分泌及Akt/NF-κB活化的影響*

徐成飛，韋立群，李通，潘曉航，甘嘉亮

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021）

染料木素又稱染料木黃酮，分布于豆科植物中的一種天然異黃酮類藥物[1]，具有多種生物活性，多種體內(nèi)外試驗中有明確的抗炎活性[2-3]，但在炎癥腸病（inflammatory bowel disease, IBD）中的作用目前尚未見報道。研究表明結(jié)腸上皮細胞與腸道免疫功能之間“crosstalk”在炎癥腸病中有著重要意義[4]，同時在IBD中腸上皮細胞與腸道中免疫細胞可能起到類似的作用[5-6]。所以本研究利用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和人干擾素γ（human interferon-gamma, hIFN-γ）誘導HT29細胞產(chǎn)生炎癥模型，探討染料木素是否具有抑制炎癥的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人結(jié)腸腺癌細胞系HT29購自上海細胞生物研究所，染料木素購自上海源葉生物科技有限公司，達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium, DMEM）購自中國維森特生物技術(shù)有限公司，噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT）購自美國Sigma公司，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）購自澳大利亞Excellbio公司，RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNase H Plus） 購 自 日 本 TaKaRa公司，酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒購自武漢華美生物科技有限公司，p-Akt（S473）、Akt、p-p65、p65 及 GAPDH 兔抗人多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞分組及處理

A組為對照組：加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；B組為模型組：給予IFN-γ20 ng/ml孵育12 h，再加入1 μg/ml LPS孵育4 h；C-E組為觀察組：在模型組的基礎上給予不同濃度的染料木素（25、50及100 μmol/L）孵育24 h。

1.3 HT29細胞培養(yǎng)

HT29細胞采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)（10%的胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素）于37℃的5% 二氧化碳CO2孵育箱中培養(yǎng)。采用對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.4 細胞增殖觀察

采用的MTT方法。取對數(shù)生長期的HT29細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，以4×103個/孔接種到96孔板中。待細胞貼壁后并分加入染料木素（0、25、50、100及200 μmol/L），每個濃度設置3個復孔。放置于5% CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液后，每孔加入二甲基亞砜150 μl避光在微量震蕩器上震蕩15 min，490 nm的酶標儀測定其吸光值，計算細胞增殖率。重復3次試驗。

1.5 白細胞介素的檢測

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real time-polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測白細胞介素1β（interleukin-1β, IL-1β）、白細胞介素6（interleukin-6, IL-6）、白細胞介素8（interleukin-8,IL-8）、白細胞介素10（interleukin-10, IL-10）的表達量。取對數(shù)生長的細胞接種于培養(yǎng)瓶中，按1.2分組及方法收集細胞。依照美國Invitrogen公司RNA試劑提取盒進行RNA提取，定量后按照逆轉(zhuǎn)錄TaKaRa試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，用逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模版進行擴增，引物由生工生物工程上海股份有限公司合成，序列見表1。反應條件：50℃孵育2 min，95℃活化10 min 1個循環(huán)，95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40個循環(huán)。基因相對表達量使用2-△△Ct進行分析。重復3次實驗。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 檢測細胞上清液中IL-8的含量

用ELISA試劑盒進行測定。收集1.2的分組方法培養(yǎng)的細胞液上清液，在4℃低溫離心機以2 000 r/min速度，離心5 min，收集上清液，置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩z測時按華美ELISA試劑盒說明書進行細胞上清中的IL-8含量的檢測。實驗重復3次。

1.7 Western blot檢測 p-Akt（S473）、Akt、p-p65、p65蛋白表達

收集1.2的分組方法培養(yǎng)的細胞，用RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF）、Cocktail提取各組細胞總蛋白量，使用核酸檢測儀檢測樣品蛋白濃度。用10%分離膠60 V恒壓電泳，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜進行半干轉(zhuǎn)，5%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）封閉1 h。分別加入稀釋為1∶1 000的p-Akt（S473）、Akt、p-p65、p65 及 GAPDH 抗體 4℃搖床過夜，在室溫避光孵育熒光二抗2 h，濃度為（1∶10 000），使用雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進行掃膜。用Image J進行蛋白灰度值的分析處理，目的蛋白比上內(nèi)參GAPDH作為蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 染料木素對HT29增殖的影響

不同濃度染料木素作用HT29細胞24 h細胞的增殖率分別為：100%、（99.34±2.67）%、（99.46±3.80）%、（98.42±0.70）%和（94.36±2.28）%，經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（F=2.869，P=0.080）。200 μmol/L以下濃度的染料木素對HT29的增殖幾乎無影響。后續(xù)研究采用25、50及100 μmol/L作為藥物實驗濃度。

2.2 各組HT29細胞中炎癥因子mRNA的表達量

5組IL-1β、IL-6及IL-10的mRNA相對表達量經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（F=1.486、1.650及1.433，P=0.278、0.237及0.293）。5組IL-8的mRNA相對表達量經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=172.048，P=0.000）；模型組較對照組表達IL-8高（P＜0.05），觀察組IL-8表達較模型組低（P＜0.05）。見表 2。

2.3 各組HT29細胞上清液中IL-8的含量

各組上清液IL-8含量分別為（112.66±7.23）、（1 420.69±76.74）、（1 258.66±93.07）、（845.77±117.06）及（446.95±72.73）pg/ml，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=133.204，P=0.000）。模型組比對照組上清液表達IL-8高（P＜0.05），觀察組上清液IL-8表達量較模型組低（P＜0.05）。

表2 IL-1β、IL-6、IL-8及IL-10的mRNA相對表達量情況 （±s）

表2 IL-1β、IL-6、IL-8及IL-10的mRNA相對表達量情況 （±s）

注：A：對照組；B：模型組；C-E分別為模型組加入不同染料木素濃度的觀察組（25、50及100 μmol/L）。1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 IL-1β IL-6 IL-8 IL-10 A 1 1 1 1 B 1.08±0.14 1.04±0.03 219.72±18.691） 1.04±0.04 C 1.09±0.11 1.01±0.01 121.21±18.582） 1.05±0.03 D 1.03±0.21 1.03±0.02 28.89±3.202） 1.05±0.04 E 1.33±0.31 1.04±0.04 23.54±2.802） 1.04±0.02 F值 1.486 1.650 172.048 1.433 P值 0.278 0.237 0.000 0.293

2.4 染料木素對HT29細胞炎癥模型Akt/NF-κB（p65）通路蛋白表達的影響

各組p-Akt（S473）和p-p65蛋白相對表達量經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=100.430、76.321，均P=0.000），模型組 p-Akt（S473）和 p-p65蛋白相對表達量較對照組高（P＜0.05），觀察組p-Akt（S473）和p-p65蛋白相對表達量比模型組低（P＜0.05）。各組Akt和p65的蛋白相對表達量經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.463和1.361，P=0.762和0.314）。見附圖和表3。

表3 染料木素對Akt/NF-κB（p65）通路蛋白表達的影響 （n =3，±s）

表3 染料木素對Akt/NF-κB（p65）通路蛋白表達的影響 （n =3，±s）

注：A：對照組；B：模型組；C～E分別為模型組加入不同染料木素濃度的觀察組（25，50及100 μmol/L）。1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 p-Akt Akt p-p65 P65 A 0.234±0.024 0.814±0.003 0.293±0.071 0.841±0.008 B 0.828±0.0191） 0.816±0.008 0.858±0.0421） 0.848±0.003 C 0.750±0.0432） 0.812±0.003 0.753±0.0162） 0.847±0.005 D 0.632±0.0292） 0.815±0.004 0.618±0.0422） 0.847±0.001 E 0.491±0.1002） 0.818±0.008 0.448±0.0372） 0.849±0.003 F值 100.430 0.463 76.321 1.361 P值 0.000 0.762 0.000 0.314

附圖 染料木素對Akt/NF-κB（p65）蛋白表達水平的影響

3 討論

IBD是累及胃腸道的慢性非特異性炎癥，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病[6]，西方發(fā)達國家是該病的主要發(fā)生區(qū)域，僅在北美地區(qū)約有150萬的患者[1]，但在過去的10年，亞洲患病人數(shù)增加1倍[7]，提示該病在世界范圍內(nèi)逐漸擴展。目前，IBD的發(fā)病機制及病因仍不明確，可能與免疫、精神、遺傳等有關，藥物控制是其主要的治療方法，包括氨基水楊酸、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等藥物[8]，其目的是緩解癥狀，改善患者的生活質(zhì)量[9]。傳統(tǒng)這類藥物治療會引一系列嚴重的副作用，如骨髓抑制、肝腎功能損害等[10]。因此，有必要尋找副作用少新的替代藥物。

染料木素于1899年從染料花中分離出來，廣泛分布在豆科植物中，具有抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[1]。近年來發(fā)現(xiàn)它具有抗炎作用。EO等[2]發(fā)現(xiàn)，喂食染料木素可以降低用四氧嘧啶誘導糖尿病大鼠的延遲損傷修復過程中的炎癥反應，并可以減輕炎癥因子的釋放。王小倩等[3]在體外試驗中發(fā)現(xiàn)染料木素可以促進AMPKα磷酸化抑制LPS誘導的RAW264.7表達腫瘤壞死因子（tumor necrosis factors, TNF-α）、IL-6。炎癥腸病的慢性炎癥可能是由于促炎因子異常持續(xù)分泌而導致[11]，而IL-8是主要的趨化因子之一。IL-8可以激活中性粒細胞，誘導其表達多種促炎因子，如：IL-6、TNF-α、IL-1β[11-12]。本研究結(jié)果顯示，IL-8 mRNA表達升高，而IL-1β、IL-6、IL-10無變化。ELISA檢測培養(yǎng)上清液中IL-8蛋白表達也升高，提示細胞炎癥模型是成功的。在此基礎上，后續(xù)給予不同濃度的染料木素處理，結(jié)果顯示染料木素能抑制IL-8 mRNA表達和細胞上清中IL-8蛋白表達，提示染料木素可能具有一定的抗炎活性。

LPS是革蘭陰性桿菌細胞壁組成部分，在許多實驗中可用來誘導產(chǎn)生炎癥反應[13]。LPS能夠特異性識別表達在巨噬細胞、上皮細胞細胞等表面的Toll樣受 體 4（toll-like receptors 4, TLR4）[14]。TLR4識 別LPS后誘導髓樣分化因子88（myeloid differentiation primary response gene 88, MyD88）依賴性細胞內(nèi)的信號傳導過程，MyD88召集IL-1受體相關激酶（IL-1 receptor-associated kinases, IRAKs）、 腫 瘤 壞 死 因子受體相關因子6（tumor-necrosis factor receptorassociated factor 6, TRAF6），從而激活核因子κB激酶抑制劑（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK）復合體，IKK磷酸化后介導NF-κB激活，處在包質(zhì)中的NF-κB被激活后轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)發(fā)揮生物學活性，使IL-8、IL-1β、TNF-α基因轉(zhuǎn)錄增強而高表達[15]，持續(xù)大量的NF-κB激活與炎癥程度呈正相關。所以NF-κB活性是炎癥程度的一個重要指標。Akt是NF-κB上游激活的信號激活，他們在調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移中起重要的作用[16]，活化的Akt也能激活NF-κB進入細胞核，促使相關炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄表達增強[17]。本研究免疫印記實驗結(jié)果顯示，隨著濃度的增大，染料木素逐漸抑制p-Akt（S473）/p-p65的活性，提示染料木素對Akt/NF-κB通路具有抑制作用。

綜上所述，染料木素能抑制LPS和hIFN-γ誘導HT29細胞的炎癥反應，其機制可能與抑制Akt/NF-κB通路有關。為深入研究染料木素抗炎作用提供一定的理論基礎。