泛素化羧基末端水解酶37在結直腸癌組織中的表達水平及意義

鄧顯倫，馮立波，徐建偉，向繼勇，夏冬

（1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 普外科，四川 瀘州 646000；2.四川省中江縣人民醫(yī)院 普外科，四川 中江 618100）

2012年的數(shù)據(jù)顯示全球新發(fā)結直腸癌病例數(shù)約為140萬[1]，為導致腫瘤相關性死亡最主要的原因之一[2]。因此，更深入的尋找與結直腸癌進展相關的分子及潛在機制顯得有尤為迫切。泛素化羧基末端水解酶37（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 37, UCH37）是去泛素化酶家族成員，其可通過從蛋白泛素連接鏈的遠端亞基水解聚泛素而抑制蛋白降解[3]。研究顯示UCH37在多種腫瘤組織中表達上調，并促進腫瘤的進展[4-5]。本研究擬檢測結直腸癌標本中UCH37的表達情況，并分析其臨床相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2010年6月-2012年12月于西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院普外科接受結直腸癌根治術，術后病理顯示所切除的腫瘤組織為結腸癌或直腸癌患者的腫瘤組織及癌旁組織標本77例。組織標本收取后分為兩部分，一部分凍于液氮中供后續(xù)提取RNA用，一部分進行石蠟包埋供免疫組織化學檢測用。入組患者在術后3個月后開始隨訪記錄，隨訪截止時間點為患者死亡或至2016年7月本研究截止日。入組患者詳細臨床病理資料見表1。所有入選本次研究的結直腸癌患者術前未進行包括放療、化療及靶向治療，術中所取腫瘤組織及相應的癌旁組織，經液氮凍存或石蠟包埋長期儲存。本研究已經西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會審核并批準，所有入組患者均親自簽署知情同意書，授權課題組使用其組織標本進行本項科學研究。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學（簡稱免疫組化） 二甲苯脫蠟2次，100%～70%梯度酒精脫水。檸檬酸鹽緩沖液高壓修復90 s。30 ml/L過氧化氫孵育20 min，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。兔抗人UCH37單克隆抗體（ab131244）（1∶100）4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。加入聚合物增強劑，37℃孵育20 min，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。加入酶標抗兔聚合物放大劑，37℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。DAB顯色，蘇木素復燃，1 ml/L鹽酸酒精分化，磷酸鹽緩沖液返藍，脫水，透明，封片。染色結果判定每個片子隨機選取10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，統(tǒng)計陽性細胞百分率及著色程度。免疫組化染色結果由兩位病理科醫(yī)師以雙盲的方式完成，兩者不一致的結果請上級病理醫(yī)師與兩人經多鏡頭顯微鏡下討論得出一致結果。陽性細胞百分率＜25%或不著色及較淡著色者為陰性，陽性細胞百分率＞25%或適中著色及深著色者為陽性。

1.2.2 RNA提取及逆轉錄 RNA提取采用Trizol法，Trizol夠自于美國Sigma公司，將液氮冷凍過的組織研磨成粉末狀，加入1 ml Trizol繼續(xù)研磨至裂解呈透明狀。12 000 r/min 4℃離心5 min，上清轉移至一新離心管中。加入裂解液1/5體積的氯仿，用力振蕩至充分乳化。12 000 r/min 4℃離心15 min。吸取上清液至一新的離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒15次，靜置10 min。12 000 r/min 4℃離心15 min。棄去上清，加入75%的乙醇1 ml，12 000 r/min 4℃離心5 min。所得沉淀加入20 μl去離子水，即為所需RNA。逆轉錄采用10 μl體系，RNA定量后，取1 μl RNA，加入5× Prime Script RT master（日本 TaKaRa 公司）2 μl，7 μl去離子水。輕柔混勻后，進行逆轉錄反應。反應條件為：37℃ 15 min RNA二級結構打開，逆轉錄酶工作；85℃ 5 s形成CDNA，置入4℃冰箱儲存。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（Quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR） 采用TaKaRa公司SYBR premix Ex TaqⅡ試劑盒進行qRT-PCR，配置PCR反應液，PCR反應采用25 μl體系，組分如下：SYBR premix Ex TaqⅡ 12.5 μl，UCH37或β-actin正向鏈引物1 μl，UCH37或βactin反向鏈引物1 μl，實時定量產物2 μl，去離子水8.5 μl。PCR反應條件為：95℃預變性30 s；95℃擴增15 s，60℃ 延伸30 s，共40個循環(huán)。反應結束后樣品置入4℃冰箱保存。UCH37引物序列：正向5'-TGTC TCATGGAAAGCGACCC-3'，反向 5'-GCCACTTGAAAA GAAAAATTAACCC-3'；β-actin引物序列：正向5'-CG TCTTCCCCTCCATCGT-3'，反向 5'-GAAGGTGTGGTGC CAGATTT-3'。計算公式為：UCH37相對表達量：

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗；相關分析用Spearman法，繪制K-M生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗；影響因素的分析采用Cox風險比例模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 UCH37 mRNA在結直腸癌及癌旁組織中的表達水平

qRT-PCR結果顯示，結直腸癌組織中UCH37 mRNA表達水平為（5.138±1.266），癌旁組織UCH37 mRNA的表達水平為（1.325±0.519）。兩者UCH37 mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.746，P=0.043），UCH37 mRNA在結直腸癌組織中的表達水平高于癌旁組織。

2.2 UCH37蛋白在結直腸癌中的表達水平

UCH37的陽性表達率在TNM Ⅰ和Ⅱ期患者為40.625%（13/32），TNM Ⅲ和Ⅳ期為 68.889%（31/45）。兩者間UCH37陽性率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.104，P=0.019），UCH37蛋白在TNM Ⅲ和Ⅳ期結直腸癌患者組織中的陽性率高于TNMⅠ和Ⅱ期結直腸癌患者。見圖1。

2.3 UCH37的表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

圖1 UCH37蛋白在結直腸癌組織中的表達 （×40，×200）

表1 UCH37與結腸癌患者臨床病理特征的相關性

UCH37的表達水平與結直腸癌患者血管侵襲情況（rs=5.729，P=0.019）和淋巴結轉移情況呈正相關（rs=4.364，P=0.04），而與其他病理特征無相關性。見表1。

2.4 UCH37的表達與結直腸癌患者術后5年總生存率的關系

根據(jù)UCH37免疫組化結果，將結直腸癌患者分為UCH37陽性組和UCH37陰性組。Kaplan-Meier生存曲線顯示，UCH37陽性組與陰性組結腸癌患者術后五年總體生存率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=3.979，P=0.049），UCH37陽性組的結直腸癌患者術后5年總體生存率低于UCH37陰性組，見圖2。

2.5 UCH37的表達水平與結直腸癌患者預后的關系

單因素分析結果顯示，TNM分期、淋巴結轉移情況、遠處轉移情況、血管侵襲及UCH37的表達水平與總體生存預期相關。多因素分析結果顯示，TNM分期、淋巴結轉移情況、遠處轉移情況、血管侵襲及UCH37表達水平均為判斷結直腸癌患者預后的分子指標。見表2。

圖2 UCH37的表達與結直腸癌患者術后5年總體生存率的關系

表2 結直腸癌患者生存時間影響因素的單因素及多因素分析Cox風險比例模型相關參數(shù)

3 討論

蛋白底物可與泛素共價性結合，而后被蛋白酶體識別并降解為小分子肽。泛素-蛋白酶體系是真核生物細胞內蛋白降解的非溶酶體途徑。去泛素化酶可水解底物蛋白上的泛素鏈之間的鏈接，從而抑制蛋白降解[6-8]。該蛋白降解調控機制參與多種的細胞生理過程，如轉錄調控、增殖、分化以及腫瘤發(fā)生[9-11]。UCH37是去泛素化酶家族成員，可去泛素化Ⅰ型活化型轉化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）受體，而使其免于被蛋白酶體降解，從而上調TGF-β依賴的基因表達[12-13]。此外，UCH37也可去泛素化Smad2和Smad3，增強其蛋白穩(wěn)定性，從而間接活化TGF-β1信號通路[14]。更為重要的是，沉默UCH37的表達可活化Caspase-9和Caspase-3而有效地誘導非小細胞肺癌A549細胞凋亡[15]。既往研究發(fā)現(xiàn)，UCH37在卵巢癌中異常高表達，并可作為卵巢癌獨立判斷預后的分子指標[16]。此外，UCH37在肝細胞癌中表達上調，并可與葡萄糖調節(jié)蛋白78（glucoseregulated protein 78, GRP78）結合而調控細胞存活[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，UCH37可通過調控Tcf7DNA的結合而活化Wnt信號通路，從而促進腫瘤進展[17]。值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)UCH37的選擇性去泛素化酶抑制劑WP1130可介導在腫瘤中激活的UCH37等去泛素化酶，從而導致抗凋亡蛋白的表達下調，促凋亡蛋白的表達上調[18]。本研究均提示UCH37可能通過促進某些原癌基因的表達而在腫瘤發(fā)生進展中發(fā)揮著重要的作用。本研究的結果進一步支持UCH37在腫瘤進展中的促癌作用，本研究發(fā)現(xiàn)UCH37在結直腸癌組織中的表達高于癌旁組織，與結直腸癌淋巴結轉移及TNM分期密切相關。生存分析結果也顯示UCH37高表達的結直腸癌患者術后五年總體生存率低于低表達患者。Cox風險比例模型結果進一步顯示UCH37為判斷結直腸癌預后的分子指標。提示UCH37在結直腸癌中可能作為癌基因發(fā)揮作用，促進腫瘤的轉移與增值。