泛素特異性蛋白酶39在非小細胞肺癌中的表達及其對細胞增殖的影響

吉曉劍，楊秀林，周厚榮，王文琴，許新梅

（貴州省人民醫(yī)院 急診內(nèi)科，貴州 貴陽 550002）

肺癌在全球范圍的發(fā)病率高居所有腫瘤的第3位[1]，而其中75%～80%屬非小細胞肺癌，患者就診時已處于晚期[2]。近年來，一系列靶向藥物和免疫藥物已在臨床上逐步應用，顯示出良好的治療效果，但非小細胞肺癌的預后仍處于較低水平，5年總體生存率僅11%[3]。因此，尋找與非小細胞肺癌進展的相關分子及潛在機制具有重要意義。

泛素特異性蛋白酶39（ubiqutin-specific protease,USP39）屬于泛素特異性蛋白酶家族成員[4]，其結構由一個鋅指泛素結合域和一個泛素化C端水解酶域組成[5]。研究表明，USP39在mRNA前體剪接中發(fā)揮著至關重要的作用。細胞中USP39的缺失將導致有絲分裂紡錘體檢查點完整性的缺陷，因此USP在細胞周期和增殖過程的調(diào)控中發(fā)揮至關重要的作用[6]。多項研究結果顯示，沉默腫瘤細胞中USP39的表達可在體內(nèi)和體外水平抑制腫瘤細胞的增殖[7-8]。然而USP39在非小細胞肺癌組織和細胞中的表達及功能，尚無研究報道。本研究擬通過免疫組織化學（簡稱免疫組化）及實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）技術檢測非小細胞肺癌、癌旁組織及細胞系中USP39的表達情況，并分析其臨床相關性及其對細胞增殖的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年6月-2016年12月于貴州省人民醫(yī)院接受全胸腔鏡非小細胞肺癌根治術的患者腫瘤組織及癌旁組織，期間共收集患者腫瘤組織及癌旁組織85例。本研究入組患者詳細臨床病理資料見表1。所有入選本研究的非小細胞肺癌患者術前未進行包括放療、化療及靶向治療，術中所取腫瘤組織及相應的癌旁組織，經(jīng)石蠟包埋長期儲存。本研究經(jīng)貴州省人民醫(yī)院倫理委員會審核并批準，所有入組患者均親自簽署知情同意書，授權課題組使用其組織標本進行本項科學研究。

1.2 試劑與儀器

免疫組化試劑盒購于福州邁新科技發(fā)展有限公司，LipoTM2000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司，USP39 NC及siRNA由美國Sigma公司合成，CCK-8試劑購于日本同仁公司，SYBR premix Ex TaqⅡ和5x Prime Script RT master購于日本TaKaRa公司，細胞凋亡檢測Annexin-V和PI試劑盒購于美國BD公司。4℃低溫離心機購于德國Eppendorf公司，BD FACS Calibur流式細胞儀購于美國BD公司。

1.3 免疫組化檢測USP39蛋白在肺非小細胞肺癌及矮胖組織中表達

二甲苯脫蠟2次，100%～70%梯度酒精脫臘。檸檬酸鹽緩沖液高壓修復90 s。30 ml/L過氧化氫孵育20 min，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。兔抗人USP39單克隆抗體（ab131244，英國Abcam公司）（1∶100）4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。加入聚合物增強劑（美國Sigma公司），37℃孵育20 min，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。加入酶標抗兔聚合物放大劑（美國Sigma公司），37℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine, DAB）（美國 Sigma公司）顯色，蘇木素（美國Sigma公司）復染，1 ml/L鹽酸酒精分化，磷酸鹽緩沖液返藍，脫水，透明，封片。染色結果判定流程為：已染色的石蠟組織片子隨機選取10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，。將呈現(xiàn)棕色或黃色的細胞定義為陽性細胞，統(tǒng)計陽性細胞的百分率，染色結果根據(jù)陽性細胞百分率及著色程度綜合判斷。將陽性細胞百分率＞25%、及不著色或較淡著色者判定為USP39陰性，將陽性細胞百分率＜35%、及染色呈現(xiàn)適中著色或深著色者為陽性。免疫組化染色結果由兩位病理科醫(yī)師以雙盲的方式完成，兩者不一致的結果請上級病理醫(yī)師與兩人經(jīng)多鏡頭顯微鏡下討論得出一致結果。

1.4 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

RNA提取采用Trizol法，Trizol購自美國Sigma公司，非小細胞肺癌細胞經(jīng)胰酶消化5 min，加含血清的培養(yǎng)基終止反應，離心后棄去廢液，加入1 ml Trizol室溫裂解5 min。12 000 r/min 4℃離心5 min，上清轉(zhuǎn)移至一新離心管中。加入裂解液1/5體積的氯仿，用力振蕩至充分乳化。12 000 r/min 4℃離心15 min（德國Eppendorf公司）。吸取上清液至一新的離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒15次，靜置10 min。12 000 r/min 4℃離心15 min。棄去上清，加入75%的乙醇1 ml，12 000 r/min 4℃離心5 min。所得沉淀加入20 μl去離子水，即為所需RNA。逆轉(zhuǎn)錄采用10 μl體系，RNA定量后，取1 μl RNA，加入5× Prime Script RT master（日本 TaKaRa 公司）2 μl，7 μl去離子水。輕柔混勻后，進行逆轉(zhuǎn)錄反應。反應條件為：37℃ 15 min使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，85℃延伸5 s，置入4℃儲存。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測USP39 mRNA的表達水平

采用日本TaKaRa公司SYBR premix Ex TaqⅡ試 劑 盒 進 行 qRT-PCR。PCR反 應 采 用 25 μl體系，配置PCR反應液，組分如下：SYBR premix Ex TaqⅡ 12.5 μl，USP39或 β-actin正 向 引 物1 μl，USP39或 β-actin反向引物 1 μl，實時熒光 定 量 產(chǎn) 物 2 μl， 去 離 子 水 8.5 μl。PCR 反 應條件為：95℃預變性 30 s；95℃擴增 15 s，60℃延伸30 s，共40個循環(huán)。反應結束后樣品保存于4℃。USP39引物序列如下：正向5'-GGCA GTAAAACTTGAGGGTGT-3'，反向5'-TTGAAGTCTCA CGCCTACATTC-3'；β-actin引物序列如下：正向5'-C GTCTTCCCCTCCATCGT-3'，反向 5'-GAAGGTGTGGTG CCAGATTT-3'。 計 算 公 式 為：USP39相 對表達量：

1.6 細胞轉(zhuǎn)染USP39 siRNA 及NC

USP39正常對照（normal control, NC）及小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）由美國Sigma公司合成，按說明書劑量使用DEPC水溶解USP39 NC及siRNA后，各取5 μl加入250 μl無血清培養(yǎng)基中，另取5 μl LipoTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司）加入250 μl無血清培養(yǎng)基中，將兩溶液混勻，室溫反應20 min。逐滴加入6孔板中，分別命名為USP39 NC組和USP39 siRNA組。

1.7 細胞增殖與凋亡檢測

96孔板配置100 μl轉(zhuǎn)染USP39 NC或siRNA細胞懸液，37℃ 5%二氧化碳CO2條件下培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)板中加入10 μl CCK-8溶液（日本同仁公司），在培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，在450 nm波長下測定吸光度值（optical delnsity, OD）。

將轉(zhuǎn)染USP39 NC及USP39 siRNA的細胞消化后離心5 min，加入流式洗液5 ml清洗2次，1 000 r/min離心5 min，棄去廢液，加入PI及FITC-Annexin V（美國BD公司），室溫孵育20 min，上機檢測。凋亡檢測所用流式細胞儀型號為美國BD公司FACS Caliur，所得數(shù)據(jù)采用隨機自帶軟件分析。

1.8 細胞周期檢測

將轉(zhuǎn)染USP39 NC及USP39 siRNA的細胞消化后離心5 min，加入流式洗液5 ml清洗2次，1000 r/min離心5 min，棄去廢液，加入PI（美國BD公司）室溫孵育20 min，上機檢測。凋亡檢測所用流式細胞儀為BD FACS Caliur（美國BD公司），所得數(shù)據(jù)采用美國Verity Software House公司Mod Fit LT軟件分析。

1.9 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。組間陽性例數(shù)差異分析采用χ2檢驗。相關性分析應用Spearman秩相關。計量資料3組間的比較，首先采用方差分析，用LSD-t檢驗進行兩兩比較。計量資料兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 USP39蛋白在非小細胞肺癌及癌旁組織中的表達情況

免疫組織化學結果顯示，非小細胞肺癌中USP39表達于腫瘤細胞包膜及包漿，非小細胞肺癌中USP39陽性例數(shù)為53例（62.353%），非小細胞肺癌組織中典型USP39蛋白陽性及陰性表達見圖1A、B。癌旁組織中未檢測到USP39的陽性表達（0.000%），癌旁組織中USP39蛋白典型陰性表達見圖1C。兩組間USP39陽性率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），USP39蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達較癌旁組織上調(diào)。見表1。

2.2 USP39的表達與非小細胞肺癌患者臨床病理特征的關系

USP39的表達水平與非小細胞肺癌患者TNM分期呈正相關，而與其他病理特征無相關性。見表1。

2.3 USP39在非小細胞肺癌細胞中的表達

qRT-PCR結果顯示USP39在正常支氣管上皮BEAS-2B細胞中的相對表達水平為（1.000±0.156），非小細胞肺癌細胞系A549及H460分別為（3.513±0.374）和（4.174±0.516），3組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=19.412，P=0.014）；A549和H460中的USP39相對表達水平高于正常支氣管上皮BEAS-2B細胞（均P＜0.05）。轉(zhuǎn)染USP39 NC的A549中USP39的表達水平為（1.000±0.087），轉(zhuǎn)染USP39 siRNA的A549中USP39的表達水平為（0.315±0.043），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.781，P=0.034）。轉(zhuǎn)染USP39 NC的H460中USP39的表達水平為（1.000±0.104），轉(zhuǎn)染USP39 siRNA的H460中USP39的表達水平為（0.273±0.032），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.975，P=0.031），USP39 siRNA組非小細胞肺癌中USP39表達水平較轉(zhuǎn)染USP39 NC組降低。

圖1 USP39蛋白在非小細胞肺癌組織及癌旁組織中的表達 （×400）

表1 非小細胞肺癌患者不同臨床病理特征癌組織USP39陽性表達率的比較

2.4 USP39對非小細胞肺癌細胞增殖的影響

USP39 NC組與 USP39 siRNA轉(zhuǎn)染后24、48、72、96及120 h的OD值比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的OD值有差異（A549：F=37.142，P=0.016；H460：F=41.421，P=0.011）；②USP NC組與USP39 siRNA組在轉(zhuǎn)染后120 h時間點的OD值有差異（A549：F=21.513，P=0.031；H460：F=19.451，P=0.042）。在120 h時，USP39 siRNA組時OD值低于USP39 NC組。③USP39 NC組與USP39 siRNA組的OD值變化趨勢有差異（A549：F=23.514和21.151，P=0.031和0.038）。見表2和圖3。

表2 轉(zhuǎn)染USP39 siRNA與NC的非小細胞肺癌增殖情況

2.5 USP39對非小細胞肺癌細胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染USP39 siRNA組非小細胞肺癌細胞凋亡細胞百分比為（24.872±3.522）和（16.324±0.423），轉(zhuǎn)染USP39 NC組非小細胞肺癌凋亡細胞百分比為（2.319±0.325）和（1.423±0.321），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（A549：t=5.982，P=0.014，H460：t=3.291，P=0.034），USP39 siRNA組凋亡細胞百分比高于USP39 NC組。見圖2。

2.6 USP39對非小細胞肺癌細胞周期的影響

圖2 USP39的表達對非小細胞肺癌細胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染USP39 siRNA組非小細胞肺癌細胞G1期細胞百分比為（50.321±3.241）和（56.253±1.458），S期細胞百分比為（34.151±3.815）和（27.891±3.871）；轉(zhuǎn)染USP39 NC組非小細胞肺癌G1期細胞百分比為（68.182±2.357）和（72.831±1.551），S期細胞百分比為（14.721±4.124） 和（16.913±1.118）。 經(jīng)t檢 驗，差異有統(tǒng)計學意義（A549：t=4.323，P=0.023，H460：t=4.851，P=0.027），USP39 siRNA 組 G1期細胞百分比高于USP39 NC組，而S細胞百分比低于USP39 NC組。見圖3。

圖3 USP39的表達對非小細胞肺癌細胞周期的影響

3 討論

本研究結果顯示，USP39蛋白在非小細胞肺癌組織中表達升高，其表達水平與非小細胞肺癌患者TNM分期密切相關。而USP39在非小細胞肺癌細胞中的表達水平高于正常支氣管上皮細胞，沉默非小細胞肺癌細胞中USP39的表達后，非小細胞肺癌細胞增殖受到抑制，細胞凋亡比例提高，細胞周期被阻滯于G1期。

去泛素化蛋白酶（DUBs）可介導生物體內(nèi)的泛素的去除和加工，在蛋白轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控中起著至關重要的作用。目前已鑒定出近100種去泛素化酶，分為5個家族，泛素化C端水解酶家族，泛素特異性蛋白酶家族，卵巢腫瘤蛋白酶家族，JAMM motif蛋白酶家族，和MJD病蛋白酶家族[4]。USP39是泛素特異性蛋白酶家族成員，但USP39因缺乏3個重要活化位點的殘基而無泛素化蛋白酶活性。但USP39對于U4/U6-U5三聚體snRNA的招募至關重要，而對于三聚體snRNA穩(wěn)定性的維持卻無作用[5]。細胞中USP39的缺失將導致有絲分裂紡錘體檢查點完整性的缺陷，其可能的機制為USP39調(diào)控Aurora B和其他mRNA的表達水平[6]。近年來一系列研究顯示，USP39在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中亦發(fā)揮著重要的作用。在結腸癌[9]、骨肉瘤[10]中，研究發(fā)現(xiàn)USP39在腫瘤組織中的表達高于配對癌旁組織。生物信息學數(shù)據(jù)庫挖掘研究顯示，USP39在肺癌組織中的表達上調(diào)[11]。值得注意的是，該研究僅基于生物信息學數(shù)據(jù)庫的挖掘證實USP39在肺癌組織中表達上調(diào)，并進一步深入研究在肺癌各分型中USP39的表達情況，及USP39與肺癌臨床病理特征的關系。與該研究結果相符，本研究結果顯示USP39在非小細胞肺癌腫瘤組織及細胞中的表達水平高于癌旁組織和正常支氣管上皮細胞。更為重要的是，筆者的研究結果顯示USP39與非小細胞肺癌的TNM分期密切相關。以上研究結果提示，USP39可能參與調(diào)控非小細胞肺癌的發(fā)生及進展，是潛在致癌分子。

在斑馬魚中，USP39的變異可阻滯細胞周期與G1期，并可下調(diào)rb1的表達水平[12]。近年來，一系列研究表明USP39在腫瘤中可作用致癌性分子發(fā)揮作用，USP39在乳腺癌[13-14]、肝細胞癌[8，15]和甲狀腺髓樣癌[7]中的表達水平上調(diào)。沉默USP39的表達水平可阻滯細胞周期并促進細胞凋亡，其可能的機制為USP39上調(diào)p-Cdc2并下調(diào)p-Cdc25c和p-myt1的表達[8]。沉默口腔鱗狀細胞癌中USP39的表達后，細胞增殖收到抑制，細胞周期被阻滯于S期和G1/M期，此外，沉默USP39還可通過活化Caspase-3和PARP而促進口腔鱗狀上皮細胞凋亡[16]。更為重要的是，研究發(fā)現(xiàn)沉默人巨細胞肺癌細胞系95D中USP39的表達后，細胞的克隆形成能力降低，凋亡細胞比例增高[11]。與既往研究結果相符，本研究結果顯示，沉默非小細胞肺癌中USP39的表達后，腫瘤細胞的增殖受到抑制，而細胞凋亡比例則提升，細胞周期被阻滯于G1期。結合既往研究和本研究結果可更充分的證明USP39在腫瘤進展中的致癌作用，其是極具潛力的腫瘤治療分子靶點。

綜上所述，USP39在非小細胞肺癌組織和細胞中的表達水平高于癌旁組織或正常支氣管上皮細胞，USP39與非小細胞肺癌患者TNM分期密切相關，沉默非小細胞肺癌細胞中USP39的表達后，非小細胞肺癌細胞增殖受到抑制，細胞凋亡比例提高，細胞周期被阻滯于G1期。提示USP39可促進非小細胞肺癌細胞增殖，可做為非小細胞肺癌生物治療研究的潛在分子靶點。