試論細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值

王閆

摘 要：在藥品檢測(cè)中我們常用到的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是一種非常方便、快速、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單的檢驗(yàn)方式，并且這種方式能夠帶來(lái)很好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，在中、美、日、英等國(guó)家的藥典中均有相關(guān)的記載，也是現(xiàn)代社會(huì)中最常用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法之一。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法有兩種：凝膠限量法和光度定量測(cè)定法。通過(guò)這兩種方式我們可以在藥品檢驗(yàn)、制藥工藝、臨床醫(yī)學(xué)等方面進(jìn)行相關(guān)的探究。本文重點(diǎn)講述的則是在藥品檢驗(yàn)方面進(jìn)行的相關(guān)探究與研討并對(duì)此作出相關(guān)的分析和解釋。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌內(nèi)毒素；藥品檢驗(yàn)；鱟試驗(yàn)法

1 鱟試驗(yàn)法的原理

細(xì)菌內(nèi)毒素（英文是Endotoxin）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁個(gè)層上的特有的一種結(jié)構(gòu)。而內(nèi)毒素可以作為外源性致熱源，激活中性粒細(xì)胞，并使中性粒細(xì)胞釋放出一種為內(nèi)源性熱原質(zhì)的物質(zhì)，可以作用于人體的體溫調(diào)節(jié)中樞進(jìn)而引起人體發(fā)熱。在靜脈注射時(shí)所使用的藥品中，所含有的細(xì)菌內(nèi)毒素如果超過(guò)一定的濃度，就會(huì)使人體的體溫升高發(fā)生熱原反應(yīng)，這就會(huì)對(duì)藥品的安全性產(chǎn)生一定的質(zhì)疑。1968年美國(guó)的兩位科學(xué)家Levin和Bang研究出來(lái)的用鱟試驗(yàn)法來(lái)檢查細(xì)菌內(nèi)毒素的方法中可以看出鱟試劑中的鱟血細(xì)胞受到細(xì)菌內(nèi)毒素的作用會(huì)發(fā)生一系列的凝集霉的反應(yīng)，形成一些用肉眼就可以觀察到的凝固蛋白凝膠。所以我們將通過(guò)這個(gè)原理用鱟試劑來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而判斷出供試品中的細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合相關(guān)規(guī)定。

2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的具體試驗(yàn)過(guò)程

2.1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的簡(jiǎn)單介紹

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的細(xì)菌內(nèi)毒素是從大腸埃希菌中提出并進(jìn)行精煉而得到的。一般會(huì)在標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)的時(shí)候使用。細(xì)菌內(nèi)毒素的用量我們用內(nèi)毒素的單位EU來(lái)表示，1EU和1個(gè)內(nèi)毒素國(guó)際單位（IU）相當(dāng)。每1ng的工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)不能夠小于2EU，也不能大于50EU，并且我們的數(shù)據(jù)要具有一定的穩(wěn)定性和均一性，不能任意波動(dòng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)前要先將手用肥皂清洗干凈，然后再用純度為75%的酒精消毒；在移液管取樣的時(shí)候要做好防止氣體混入到移液管當(dāng)中的準(zhǔn)備；反應(yīng)的過(guò)程中為了防止凝膠破碎進(jìn)而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果所以我們要保持試管比較平穩(wěn)的移動(dòng)避免大幅度的震動(dòng)；在靈敏度的重新檢驗(yàn)和干擾試驗(yàn)的時(shí)候兩組實(shí)驗(yàn)應(yīng)該同時(shí)進(jìn)行；整個(gè)試驗(yàn)應(yīng)該在干凈的環(huán)境當(dāng)中進(jìn)行，防止有其他的微生物對(duì)試驗(yàn)造成不必要的干擾。

2.3 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前的準(zhǔn)備工作

先把實(shí)驗(yàn)玻璃器皿放在酪酸洗液或者其他的熱原滅活劑或清洗劑中充分的浸泡，然后將洗液處理干凈并用蒸餾水將玻璃皿沖洗三遍以上；再將玻璃皿放在250℃的干燥箱中干烤30分鐘以上，以除去可能存在的其他外源性內(nèi)毒素對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生的干擾。

2.4 對(duì)鱟試劑的靈敏度進(jìn)行再次檢驗(yàn)

根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（A），將細(xì)菌內(nèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)品和專門的專門的檢查水利用旋渦混合器混合溶解15分鐘，完成之后再逐級(jí)兩倍稀釋，并計(jì)算出鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（AC）。對(duì)鱟試劑的靈敏度進(jìn)行再次檢驗(yàn)時(shí)要嚴(yán)格執(zhí)行每批選擇新的鱟試劑。除此之外我們還要將稀釋倍數(shù)加大的試劑進(jìn)行不干擾試驗(yàn)，排除其他干擾因素的影響。

2.5 實(shí)驗(yàn)的具體操作過(guò)程

取四個(gè)相同的試管，在每個(gè)試管中都加入0.1ml的鱟試劑和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水0.1ml，是兩種溶液相溶解。取其中的任意兩只試管，并在試管中加入最大稀釋倍數(shù)的供試品溶液0.1ml，并將這兩只試管作為供試品試管。在從剩下的兩只試管中取其中的任意一只加入2A內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1ml作為陽(yáng)性對(duì)照管，在最后剩下的一只試管中加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水0.1ml作為陰性對(duì)照管。將試管混勻封口后放在（36-38）℃的水浴中保溫1小時(shí)，然后取出慢慢倒轉(zhuǎn)180°并對(duì)試管進(jìn)行觀察，如果試管內(nèi)的凝膠附著在試管壁上沒(méi)有明顯的改變則記為陽(yáng)性（+），如若不然則為陰性（-）。供試品兩個(gè)試管都是陰性才符合規(guī)定。

3 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在藥用原料、注射制劑方面的探究與研討

3.1 在化學(xué)藥品方面的探究與研討

《中國(guó)藥典》中有用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET法）檢查熱原的藥品有73個(gè)品種的原料藥及其注射劑共205個(gè)。并且在之前的部分相關(guān)報(bào)道中說(shuō)可以用BET法檢查化學(xué)原料藥及注射制劑中的熱原有卡鉑原料藥、五種氨基酸原藥、三磷酸胰苷二鈉注射液、注射用脫氧核糖核酸等四十余種。在臨床醫(yī)學(xué)中如果有氰化物、硝酸、亞硝酸鹽中毒現(xiàn)象發(fā)生，同上會(huì)選擇亞甲藍(lán)注射液來(lái)解毒，他的細(xì)菌內(nèi)毒素的含量是影響該藥品質(zhì)量的重要指標(biāo)。相關(guān)研究人士用動(dòng)態(tài)比濁法對(duì)亞甲藍(lán)注射液和低分子量肝素鈣注射液進(jìn)行相關(guān)的測(cè)定，并將測(cè)定的結(jié)果與凝膠法得出的結(jié)果相對(duì)比，發(fā)現(xiàn)亞甲藍(lán)注射液的濃度為0.125mg/ml時(shí)并沒(méi)有產(chǎn)生太大的干擾，所得到的數(shù)據(jù)是10mg/ml的樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素均<0.25EU/ml；低分子量肝素鈣注射液稀釋到12.5IU/ml時(shí)對(duì)試驗(yàn)沒(méi)有任何的干擾作用，當(dāng)對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量的檢查時(shí)，發(fā)現(xiàn)其含量均<0.01IU/ml，與凝膠法測(cè)的結(jié)果基本一致，所以就得出這兩個(gè)品種可以用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。

3.2 在中藥試劑方面的探究與研討

在當(dāng)下的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，明確指出有四個(gè)化學(xué)藥注射劑（含中藥成分）規(guī)定用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法來(lái)代替PT法。有的文獻(xiàn)指出，金葉敗毒注射液、舒血寧注射液、燈盞花素注射液等近20個(gè)品種都是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的中藥注射劑的成分。有些有識(shí)之士認(rèn)為可以在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上對(duì)紫杉醇注射液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在進(jìn)行相關(guān)的測(cè)定，以確定紫杉醇注射液的內(nèi)毒素L不干擾試驗(yàn)的濃度。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明現(xiàn)在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中所確定的內(nèi)毒素的含量L=0.4EU/ml不能改變，三批紫杉醇注射液的干擾試驗(yàn)0.075mg/ml是符合要求的。但是也有一部分有識(shí)之士認(rèn)為可以通過(guò)半定量法去計(jì)算生脈注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，覺(jué)得該藥品可以用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法去探究。

4 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的應(yīng)用

凝膠法最早是由美國(guó)藥典在1980年進(jìn)行相關(guān)論述，并把這個(gè)方法作為仲裁法在美國(guó)、歐洲、日本等多個(gè)國(guó)家進(jìn)行藥品的檢驗(yàn)。在其后動(dòng)態(tài)濁度法、顯色基質(zhì)法、電泳法、酶聯(lián)免疫等都有了很快的發(fā)展，它的優(yōu)勢(shì)就在于降低了無(wú)關(guān)干擾并且檢查的速度相對(duì)來(lái)說(shuō)是比較快的。在不斷發(fā)展的自動(dòng)化現(xiàn)代社會(huì)，各個(gè)國(guó)家都開(kāi)始使用儀器自動(dòng)化檢測(cè)并用儀器對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做出相應(yīng)的分析和總結(jié)。此外，細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)所用的試劑量和樣品量的要求在不斷地降低，所用的鱟試劑也是少之又少，并且有很好的靈敏度和抗干擾的能力。

5 總結(jié)

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在我國(guó)藥品檢驗(yàn)中是一項(xiàng)非常重要的質(zhì)控技術(shù)，許多國(guó)家也在此領(lǐng)域展開(kāi)了新的探索，以前對(duì)熱原檢查沒(méi)有做出相關(guān)要求的品種也在逐步開(kāi)始使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行檢驗(yàn)，雖然我國(guó)在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法方面的成就還存在一定的缺陷也不是特別突出，但是我們國(guó)家也在不斷地突破和創(chuàng)新，為我國(guó)的藥品檢驗(yàn)做出了巨大的貢獻(xiàn)。

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