四種抗生素對果蠅學習記憶影響及其分子機理研究

葛仟鴻 楊遠媛 杜書文

（北京市第三十五中學，北京 100035）

抗生素是一種能夠殺死或者抑制細菌生長的藥物。常用的抗生素包括: β-內酰胺類，氨基糖苷類，利福霉素類和四環素類。抗生素雖能有效抑菌或殺菌，但其濫用也會造成很多負面作用。抗生素的濫用不僅會導致超級耐藥菌產生，也會對大腦功能產生損害。混合抗生素會降低小鼠新生神經元的數量并影響小鼠記憶功能。向發育期的Sprague Dawley (SD)鼠腹腔注射青霉素會損傷學習記憶功能。利福平被認為能在急性腦梗中保護神經元。多西環素能顯著地減弱恐懼記憶的遺忘速度。腹腔注射慶大霉素會導致小鼠下丘核中的神經營養因子(Neurotrophin-3,NT-3)表達量顯著性降低，該結果被認為是解釋慶大霉素導致耳中毒(Ototoxicity)的原因。認知功能包括很多方面，例如學習功能，記憶功能還有記憶靈活性，而抗生素對多種認知功能的作用評價鮮有報道。果蠅作為一種模式生物被廣泛的應用于認知功能機理探索。

本研究將利用果蠅探索了臨床常用但屬于不同類型的四種抗生素(青霉素鉀、慶大霉素、利福平和鹽酸多西環素)對嗅覺學習能力、記憶能力和認知靈活性的影響并對分子機理進行初步探索，為進一步認識不同抗生素對認識功能的影響提供線索。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系

本研究采用白眼、直翅的野生型w(isoCJ1)作為動物模型。所有測試果蠅的均飼養在恒溫24℃, 恒濕42% RH的蠅房中，并保持12小時/12小時晝夜控制，保證果蠅正常節律。

1.2 抗生素配制與給藥

四種抗生素均避光室溫保存。在給藥當天，分別秤取125mg或250mg抗生素用于配制低和高濃度實驗藥物溶液。4%蔗糖溶液(含0.5% Tween80)作為溶媒。給藥方式是將藥液滴加到塑料管中的濾紙上，果蠅通過吮吸濾紙上藥液給藥。本實驗中分別用KS1、KS2、KS3、KS4代表青霉素鉀、利福平、鹽酸多西環素和慶大霉素。

圖1 高濃度給藥下果蠅壽命曲線

圖2 低濃度給藥下果蠅壽命曲線

圖3 學習能力，記憶能力和認知靈活性測試范式

圖4 果蠅學習能力測試

圖5 果蠅記憶能力測試

1.3 果蠅嗅覺學習和記憶測試方法

將約100只果蠅裝入帶有導電銅網的訓練管，按照先后順序通入3-octanol(OCT)和4-methylcyclohexanol (MCH)兩種不同的氣味，在通第一個氣味(CS+)時，訓練管的銅網通電(US)，果蠅被電擊；當通第二個氣味時(CS-)，銅網不通電。該過程稱為訓練。在學習能力、1小時記憶能力和記憶靈活性評價測試中，訓練后的果蠅分別在訓練后5分鐘、60分鐘以及兩個連續訓練之后的5分鐘后被迅速導入T-maze中。T-maze的兩端分別同時通入OCT和MCH，果蠅對兩種氣味進行選擇。果蠅行為指數是用選對(CS+)的果蠅的數量減去選錯果蠅(選CS-)的數量，除以兩者總果蠅數量并乘以100%。

圖6 果蠅認知靈活性測試

圖7 氣味分辨能力測試

圖8 生化檢測KS1和KS4對PKC和Rac影響

1.4 果蠅氣味辨別測試訓練

將沒有經過伴隨電擊訓練的果蠅直接放入T-maze中，一側通入空氣，另一側通入OCT或MCH氣體。根據給藥組與對照組果蠅選擇空氣端的數量計算出行為，并依據行為指數判斷果蠅辨別氣味的能力是否因給藥而受到損傷。

1.5 蛋白印記實驗

給藥后24小時的果蠅(每組約600只)收集并放入液氮20秒，之后取出震蕩過篩收集果蠅頭部。之后加入裂解液并進行研磨。研磨液經過12000rpm 4℃離心20分鐘，上清液保存在-20℃。配制15%的SDSPAGE膠，并進行標準蛋白印記實驗。抗體信息：Anti-Actin (1:8000)購自拜爾迪，PKC(1:2000)和磷酸化PKC(1:4000)購自BD, Rac1總蛋白(1:4000)購自Cytoskeleton LLC, PAK-beads購自Cytoskeleton LLC。激活的Rac1 (Rac1-GTP)檢測采用之前報道方法。二抗分別采用Mouse-HRP和Rabbit-HRP(購自拜爾迪)，ECL發光液購自Millipore。條帶分析采用Image-J，數據分析采用GraphPad Prism 6版本。

1.6 數據統計

本實驗中的分析采用student’s T-test，*代表p＜0.05，**代表p＜0.01，***代表p＜0.001。n.s代表無統計學差異。

圖9 KS1和KS4對PKC磷酸化水平影響

圖10 KS1和KS4對Rac激活水平影響

2 結果

2.1 125mg/mL是最佳給藥濃度和給藥24小時是最佳給藥時間

為模擬抗生素過量所導致的影響。在不影響果蠅壽命的前提下，我們給予果蠅足量的藥量以及足夠長的藥物暴露時間。因此，首先探索高濃度藥液(250mg/mL)對果蠅壽命的影響。結果如圖1所示，高濃度(250mg/mL)組中，所有果蠅在給藥后4小時均未出現死亡。給藥24小時之后，對照組(Ctrl)中95%的果蠅存活，KS1-KS4組的存活率分別是75%，100%，100%和75%。給藥48小時后，對照組中75%的果蠅存活，KS1-KS4組的存活率分別是30%，95%，25%和10%。說明果蠅在長時間(＞24小時)攝取高劑量抗生素對壽命有影響，而短期(4小時) 給藥沒有影響。為了讓果蠅有較長的藥物暴露時間，我們又進行低濃度藥液對果蠅壽命影響的實驗。在低濃度(125mg/mL)給藥實驗中，結果如圖2所示，所有實驗組在給藥后4小時均未出現果蠅死亡，在給藥24小時之后，僅對照組果蠅出現5%數量死亡，所有抗生素組均未出現果蠅死亡。在給藥48小時之后，對照組有75%的果蠅存活，KS1-KS4組的存活率分別是40%，95%，80%和15%。因此后續實驗采用125mg/mL濃度作為實驗濃度，24小時作為給藥時長，原因是在該濃度和該給藥時間內，所有果蠅均攝取了抗生素溶液并且無明顯壽命影響。

2.2 四種抗生素對果蠅學習能力的影響

本研究首先檢測了果蠅在給藥24小時(125mg/mL)濃度下，對于嗅覺學習能力的影響。行為范式如圖3C1所示，結果如圖4所示，健康對照組(Ctrl)的學習行為指數是78，而KS1-KS4的學習行為指數分別是69，79，70和59。經過統計分析發現KS4與健康對照組相比，學習能力顯著性下降(p=0.0048)，而其他抗生素均不對果蠅嗅覺學習能力產生影響。

2.3 四種抗生素對果蠅1小時記憶能力的影響

記憶能力測試行為范式如圖3中C2所示，實驗結果如圖5所示，健康對照組(Ctrl)的60分鐘記憶指數是55，而KS1-KS4的學習指數分別是75，65，57和58。經過統計分析發現KS1與健康對照組相比，1小時記憶能力顯著性增強(p=0.0035)，而其他抗生素均不對果蠅嗅覺記憶能力產生影響。

2.4 四種抗生素對果蠅認知靈活性的影響

記憶的靈活性是認知功能的重要指標，多種自閉癥相關基因突變均會降低記憶的靈活性。本研究通過反轉訓練(Reverse Training)的范式對記憶靈活性進行檢測如1C3所示。實驗結果如圖6所示健康對照組果蠅的行為指數是54.5，KS1-KS4組的行為值分別是42，49，54,和48。所有給抗生素組的果蠅均表現出與健康對照組無差異的行為值。

2.5 KS4不影響果蠅的嗅覺功能

從學習能力測試發現，KS4(慶大霉素)會損傷果蠅的嗅覺學習能力，為了排除KS4不是通過損傷了果蠅的嗅覺系統功能而產生了嗅覺學習能力降低的結果，我們檢測了KS4給藥組對氣味的分辨能力(方法如1.4所述)。結果顯示相比于對照組，KS4并不影響果蠅對OCT和MCH氣味的辨別能力(圖7)，因此可以確定KS4造成的學習功能損傷有由于學習相關分子機制改變導致的。

2.6 KS4損傷學習能力，KS1促進記憶維持的分子機理研究

蛋白激酶C (the protein kinase C, PKC)在跨膜信號傳導中發揮著極為重要的作用，因此被認為“記憶激酶”。諸多證據都表明它參與記憶的獲取和維持，降低PKC的磷酸化水平會導致學習能力損傷，而增強PKC磷酸化水平能夠促進提高學習能力和記憶維持。行為實驗發現KS4會損傷果蠅學習能力，因此通過蛋白印記檢測KS4給藥后果蠅大腦中總PKC和PKC磷酸化水平的變化，結果發現KS4給藥24小時之后，果蠅大腦中PKC蛋白磷酸化水平顯著下降(圖8代表性生化結果，圖9為統計結果)，但KS4不改變總PKC的含量，因此說明KS4可能通過產生降低PKC磷酸化水平導致學習能力下降。我們還檢測了KS1給藥24小時之后對果蠅的PKC活性的影響，結果發現KS1不影響PKC磷酸化水平和總PKC含量(圖9)，由此得出KS1增強果蠅一小時記憶不通過PKC分子通路。有報道發現小G蛋白Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1)參與記憶遺忘調控，Rac1-GTP是Rac1的激活態，持續激活Rac1會促進記憶的遺忘，而抑制Rac1活性能抑制遺忘。我們檢測了KS1和KS4在給予果蠅24小時之后，果蠅大腦中Rac1活性的改變，結果發現KS1和KS4均不影響影響Rac1激活態和總Rac1的含量(圖8代表性生化結果，圖10為統計結果)。

3 結語

本研究利用果蠅模型，探索了四種不同抑菌機制的抗生素對果蠅嗅覺學習能力，記憶能力和認知靈活性的影響。通過果蠅行為實驗和生化實驗實驗，我們發現：（1）過量及長時間攝入抗生素對壽命有一定的損傷，但我們意外發現利福平(KS2)在壽命實驗中，能起到一定的壽命延長的作用(圖1和圖2)，有研究認為利福平有保護神經元的功能。（2）低劑量慶大霉素會通過抑制PKC磷酸化導致學習能力下降。在小鼠實驗中發現慶大霉素會導致小鼠下丘核中的神經營養因子表達量顯著性降低。（3）低劑量青霉素鉀能促進果蠅1小時記憶的維持，生化實驗證明其增強記憶維持功能不是通過提高PKC磷酸化及抑制遺忘分子Rac激活，而是通過其他分子通路。

近年來，越來越多的研究發現腸道菌群會參與認知功能的調節，抗生素會通過改變腸道菌群的種類和數量影響大腦神經生長因子，本研究結合果蠅行為學對四種常用抗生素對認知功能的影響進行了探索，并對其作用機理進行了初步探索。