Notch信號通路在燒傷感染患者淋巴細胞中的表達研究

倪少俊 雷 悅 徐秋月 王 成 劉瓏玲

1.遵義醫學院第五附屬（珠海）醫院燒傷整形手外科，廣東珠海 519100；2.遵義醫學院珠海校區免疫實驗室，廣東珠海 519090

燒傷患者由于皮膚的完整性受到破壞，其基本功能受到明顯損害而失去平衡，使得燒傷患者發生感染的概率有明顯且逐漸增加的趨勢[1]。在燒傷患者死亡危險因素中，感染是最主要危險因素之一[2]。研究顯示，T、B細胞的分化、發育都離不開Notch信號通路的參與[3-5]。燒傷患者機體存在細胞免疫功能低下的同時也會表現出對炎性反應的增強[6-7]，這些病理變化是否有Notch信號通路的參與值得探討。本課題旨在通過研究Notch信號通路在燒傷感染患者外周血淋巴細胞（peripheral blood lymphocytes，PBL）中的表達，探討Notch信號通路與燒傷感染患者淋巴細胞的關系，闡明Notch信號在燒傷感染調節中的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院燒傷科2016年7月～2017年7月收治的15例燒傷感染患者作為燒傷感染組，采用中國新九分法估算患者燒傷面積，三度四分法估算患者燒傷深度，其中男8例，女7例；年齡為 21～46歲，平均（36.8±7.90）歲；21歲 2例,32 歲 3 例，37 歲 4 例，40歲1例，44歲2例，46歲3例。選取同期在我院進行健康體檢的15例健康者作為對照組，其中男9例，女6例；年齡為 19～52 歲，平均（36.27±10.64）歲；19 歲 1 例，23歲3例，34歲2例，36歲4例，44歲2例，52歲3例。兩組的一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準，入選本研究的對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

TRIZOL試劑購自美國Invitrogen公司，cDNA合成試劑盒購自德國Qiagen公司，SYBRAdvantageqPCR Premix試劑盒購自日本Takara公司，兔抗人Notch 1和Notch 2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本收集及淋巴細胞分離 根據分組結果，分別采取燒傷感染組和健康對照組研究對象的靜脈血3～5 ml，肝素抗凝管收集血液樣本，人PBL分離液分選獲得PBL，操作步驟按試劑說明書進行。收集后的淋巴細胞分成兩部分，一部分用于提取總RNA，一部分用于提取總蛋白。

1.3.2 實時熒光定量 PCR（real-time PCR，RT-PCR）檢測Notch 1和Notch 2基因mRNA的表達 采用經典的TRIZOL法提取樣本細胞的總RNA，取1 μl RNA樣品測定A260/A280比值，確保其濃度和純度符合要求后，其余放在-80℃冰箱中保存備用。cDNA的合成嚴格按照反轉錄試劑盒說明書進行操作。采用Takara公司SYBRAdvantageqPCR Premix試劑盒進行PCR反應，總反應體積為20 μl，每個樣本做3個重復，取平均值作為最終數值。Notch 1和Notch 2基因及內參β-actin引物序列參照文獻[8]，引物由上海生工生物工程有限公司合成，其具體序列見表1。RT-PCR結果采用 2-ΔΔCt方法運算。

表1 Notch1和Notch2基因及內參引物序列

1.3.3 免疫印跡法（Western-blot）檢測Notch 1和Notch 2蛋白 裂解PBL提取蛋白，BCA法進行蛋白質定量，根據蛋白濃度計算蛋白及上樣緩沖液的體積，總蛋白中加入5×Buffer蛋白上樣緩沖液，沸水浴15 min，每個泳道蛋白上樣20 μg，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后恒流濕法轉膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h后，加入免抗人Notch 1和Notch 2抗體（稀釋比為1∶750）4℃旋轉孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。加辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG二抗（稀釋比為 1∶1000），孵育 1 h，TBST 洗膜 3次，每次3 min。加入ECL化學發光液，成像儀上進行曝光，對圖像進行灰度分析。結果以目的蛋白灰度值與GAPDH蛋白灰度值之比來表示。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用 t檢驗，以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 燒傷感染患者PBL中Notch 1和Notch 2基因mRNA水平的變化

RT-PCR結果顯示，燒傷感染患者PBL中Notch 1和Notch 2基因mRNA表達水平分別是健康人的6.73倍和2.56倍。與健康人相比，燒傷感染患者PBL中Notch 1和Notch 2基因mRNA水平均顯著性高于健康人群（P＜0.05）（圖 1）。

圖1 熒光定量PCR檢測

2.2 燒傷感染患者PBL中Notch 1和Notch 2蛋白水平的變化

Western-blot檢測燒傷感染患者與健康人群PBL中Notch 1和Notch 2蛋白表達結果顯示，健康人與燒傷感染患者的PBL都有Notch 1和Notch 2蛋白表達，并且兩者在燒傷感染患者中的表達皆顯著高于對照組（P＜0.05）（圖 2）。

圖2 Western-blot檢測

3 討論

Notch信號通路是一個古老的信號傳導途徑，在各種低等級和高等級動物中都廣泛存在，并且在物種進化過程中保持高度保守性，Notch受體通過與鄰近細胞的配體相互作用來精確調節各譜系細胞和組織的分化，是一條影響細胞命運的信號轉導通路。完整的Notch信號通路組成包括Notch受體、Notch配體和細胞內效應分子DNA結合蛋白以及Notch的調節分子等[9]。國內外的研究顯示，Notch信號在外周免疫系統中發揮重要作用，對免疫細胞分化和調節過程的作用尤為顯著[10-11]。特異性抗原激活淋巴細胞后進行特異性的克隆擴增，促使Notch 1受體表達基點上調；同時T細胞亦對相關的細胞因子（如IL-1、IL-4、IL-10等）作出了一系列反應、調節。T細胞在生長過程中由這些細胞因子通過信號傳導并且誘導進行定向分化[12]，Notch信號通路又通過一系列途徑促進淋巴細胞分化、增殖。Notch信號也可以通過調節淋巴細胞表面CD25的表達以及增強NF-κB的活性，促進干擾素-γ的分泌等途徑來促進淋巴細胞的增殖、活化[12-18]，除了 T 細胞，Palaga等[19]的研究顯示，Notch 信號也參與巨噬細胞免疫功能的調控。在本研究中，健康人和燒傷感染患者的外周血中都有Notch 1的表達，并且在燒傷感染患者的外周血中表達更高，提示機體在受到感染后通過上調Notch 1的表達來增強免疫系統的功能對抗入侵的病原微生物。

Notch 2作為Notch信號通路的一個重要受體，在機體的外周免疫系統中發揮著復雜的生理病理作用。 秦亞錄等[20]的研究顯示，Notch 2、3、4-Jagged-1 介導的Notch信號通路激活與外周血炎癥因子（IL-1β、IL-8、TNF-α）的高表達與Notch信號通路激活有關。采用基因敲除或者基因沉默方法的研究顯示，Notch 2信號可促進Th2分化，Notch 2或Notch 1信號通過促進GATA-3和IL-4的表達來誘導Th2分化。彭思璐等[21]的研究顯示，慢性乙型肝炎患者易感染病原菌，且感染后患者血清中Notch 1和Notch 2蛋白水平明顯升高，此結果與本課題的研究結果類似。

Notch信號通路對免疫系統的影響還有待進一步研究，筆者從臨床角度對Notch信號通路進行了初步的探索，遺憾的是，受條件所限本研究沒有得到進一步深入?？偠灾琍BL中Notch通路的Notch 1、Notch 2受體的表達與外周免疫系統的諸多生理和病理活動密切相關，通過檢測PBL中兩個重要Notch受體表達水平的變化，能夠為臨床醫生全面了解燒傷患者的感染程度和判斷預后提供有價值的參考，將Notch受體的表達變化作為參考指標以選擇合適的治療方案，具有較高的臨床應用價值。如果能將Notch 1和Notch 2受體聯合其他多種免疫細胞因子檢測，如抗炎因子、促炎因子等，有望進一步增加其敏感度和特異性，提高和拓展其臨床診斷與治療方面的應用。