復(fù)合氨基酸-鐵、鋅、銅配合物的合成及其抗腫瘤抗菌生物活性研究

吳 菁

南昌市第一醫(yī)院藥劑科，江西南昌 330008

復(fù)合氨基酸是人體生命運(yùn)動(dòng)中所必須的基本物質(zhì)，具有增強(qiáng)人體免疫功能、加強(qiáng)營養(yǎng)吸收的作用，能夠緩解身體和精神的疲勞，能夠改善肝腎功能以及增加記憶力等。有關(guān)研究報(bào)道，化合物與金屬元素，特別是人體必需微量元素，發(fā)生配合反應(yīng)時(shí)，其活性會(huì)顯著增加[1-7]。鐵、鋅、銅都是人體必需的微量元素，對人體的生理功能具有促進(jìn)作用。本研究將復(fù)合氨基酸和鐵、鋅、銅三種人體必需微量元素進(jìn)行配位化學(xué)反應(yīng)，并研究其抗腫瘤抗菌作用，以期獲得活性更強(qiáng)的藥物，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

復(fù)合氨基酸（苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、胱氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、天門冬氨酸、蘇氨酸、色氨酸、絲氨酸、羥脯氨酸、精氨酸、脯氨酸）（購于深圳市萬和制藥有限公司，生產(chǎn)批號H20000478，純度>99%，相對分子質(zhì)量為 126）；Fe2（SO4）3（分析純）；ZnSO4·7H2O（分析純）；CuSO4·5H2O（分析純）；氫氧化鈉（分析純）；96 孔培養(yǎng)板（美國Costar公司）；健康昆明小鼠[體重（22±2）g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買，證號SCXK（渝）2007-0001]；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；85-1恒溫磁力攪拌器（常州國華電器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合氨基酸鐵、鋅、銅配合物的合成 稱取30 g復(fù)合氨基酸，加入純水，攪拌并過濾去掉不溶解的成分，平行制備3份溶液。分別稱取硫酸鐵、硫酸鋅、硫酸銅與氫氧化鈉反應(yīng)，得氫氧化鐵、氫氧化鋅、氫氧化銅沉淀，分別將3種沉淀加入配置好的復(fù)合氨基酸溶液中，分別按復(fù)合氨基酸:金屬離子（摩爾比）=2:1進(jìn)行反應(yīng)，設(shè)定溫度在60℃左右，再進(jìn)行水浴加熱，逐漸加熱至80℃，不斷滴加氫氧化鈉溶液，反應(yīng)6～12 h，過濾，除去未反應(yīng)不溶物質(zhì)，得深藍(lán)色濾液，加丙酮溶液立即沉淀，60℃烘干，得藍(lán)色固體產(chǎn)物。

1.2.2 復(fù)方氨基酸、復(fù)合氨基酸鐵、鋅、銅配合物小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn) 將復(fù)合氨基酸鐵、鋅、銅配合物、復(fù)方氨基酸溶于純水，配置為60%的溶液，按文獻(xiàn)要求的最大耐受劑量法[8]對每只小鼠進(jìn)行灌胃給藥，給藥量為5 g/kg，并觀察兩周，記錄小鼠的生存情況。

1.2.3 復(fù)合氨基酸鐵、鋅、銅配合物的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)方法 將腫瘤細(xì)胞（A549、HepG2），用含胚牛血清（濃度為10%）的RPMI-1640培養(yǎng)基配置成細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml。將上述細(xì)胞接種在96孔板中，每個(gè)孔加入的量為 100 μl，放置在溫度 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)的時(shí)間為24 h。吸出并更換培養(yǎng)基后，加入 5 個(gè)濃度（20、40、80、160、320 μmol/L）的復(fù)合氨基酸、復(fù)合氨基酸鐵、鋅、銅配合物，每孔 100 μl，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，空白組只加培養(yǎng)基。之后繼續(xù)放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，再在每個(gè)孔中加入MTT培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為4 h，培養(yǎng)后棄上清液，再加入DMSO，振蕩，將96孔板放置在在酶標(biāo)儀中，于570 nm處測定吸光度。計(jì)算公式，抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組A值）/對照組A值×l00%，計(jì)算結(jié)果。

1.2.4 復(fù)合氨基酸鐵、鋅、銅配合物抗菌實(shí)驗(yàn) 采用微生物劃線法將沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌培養(yǎng)后，細(xì)菌配置的濃度為2×105個(gè)/ml，在96孔板中使用倍比稀釋法稀釋為 5個(gè)濃度（2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 mg/ml）的復(fù)合氨基酸鐵、鋅、銅配合物，上述每個(gè)濃度再設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，再在每個(gè)孔中加入相等量濃度的菌液，細(xì)菌在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為24 h，通過觀察96孔板是否為透明，對應(yīng)幾種藥物溶液濃度最小的透明的孔，該孔即為該藥物的最小抑菌濃度MIC。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合氨基酸-鐵、復(fù)合氨基酸-鋅、復(fù)合氨基酸-銅配合物的產(chǎn)率

反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)烘干恒重后，稱量產(chǎn)物重量，計(jì)算產(chǎn)率，結(jié)果見表1。

表1 復(fù)合氨基酸-鐵、復(fù)合氨基酸-鋅、復(fù)合氨基酸-銅配合物的產(chǎn)率

2.2 三種金屬配合物中鐵、鋅、銅的配位比及金屬含量

為確定復(fù)合氨基酸鐵、鋅、銅三種金屬配合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，即復(fù)合氨基酸與鐵、鋅、銅三種金屬的配位比，采用EDTA滴定法測定所得產(chǎn)物中鐵、鋅、銅的含量，結(jié)果見表2。

表2 三種金屬配合物中鐵、鋅、銅的配位比及金屬含量

2.3 急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

復(fù)方氨基酸及復(fù)合氨基酸-鐵、復(fù)合氨基酸-鋅、復(fù)合氨基酸-銅配合物灌胃給藥后，所有小白鼠的活動(dòng)雖然會(huì)稍微減弱，但均能快速地恢復(fù)正常，無論是呼吸、食量還是其他各項(xiàng)活動(dòng)均顯示為正常，沒有出現(xiàn)中毒的癥狀。連續(xù)給藥2周，所有小鼠都沒有死亡，并且未出現(xiàn)任何中毒的癥狀，提示復(fù)合氨基酸及鐵、鋅、銅等3種配合物對小鼠灌胃給藥的急性毒性（LD50）＞5000 mg/kg。 根據(jù) LD50劑量分級，三種金屬配合物經(jīng)口給藥都屬于實(shí)際無毒范圍。

2.4 抗腫瘤作用結(jié)果

采用MTT法測定復(fù)合氨基酸及其三種金屬配合物對 A549、HepG2 的 IC50，結(jié)果見表 3。

表3 復(fù)合氨基酸及復(fù)合氨基酸-鐵、鋅、銅配合物的IC50值（μmol/L）

2.5 抗菌作用結(jié)果

采用倍比稀釋方法考察復(fù)合氨基酸及其三種金屬配合物對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑制作用，結(jié)果見表4。

表4 復(fù)合氨基酸及復(fù)合氨基酸-鐵、鋅、銅配合物的MIC值（mg/ml）

3 討論

復(fù)合氨基酸有些為人體所必須的氨基酸，而鐵、鋅、銅雖然也是人體必需微量元素，但服用過量也有一定毒性，文獻(xiàn)報(bào)道，有機(jī)化合物與金屬離子發(fā)生配合反應(yīng)生成配合物后毒性會(huì)降低[9-10]，這與本研究急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，復(fù)合氨基酸-鐵配合物、復(fù)合氨基酸-鋅配合物、復(fù)合氨基酸-銅配合物三種金屬配合物對小鼠均無毒，原因有可能是無機(jī)金屬離子過量本身是有毒性的，但是經(jīng)過與有機(jī)物反應(yīng)后，金屬鍵轉(zhuǎn)變?yōu)榕湮还矁r(jià)鍵，金屬離子的毒性消失或降低。復(fù)合氨基酸與鐵、鋅、銅三種金屬的配位比均為2:1，推測是氨基酸的氨基和羧基與金屬離子發(fā)生了配位反應(yīng)，因氨基和羧基均有孤對電子，可將電子提供給缺電子的正價(jià)金屬離子。

另外，實(shí)驗(yàn)合成的3種復(fù)合氨基酸金屬配合物，抗腫瘤抗菌作用均強(qiáng)于復(fù)合氨基酸，表明復(fù)合氨基酸與金屬離子反應(yīng)生成配合物后，其生物活性顯著增強(qiáng)，因?yàn)楹芏喟被岷徒饘匐x子本身具有抗菌抗腫瘤的作用，而將二者通過化學(xué)方法合成新的產(chǎn)物，可能發(fā)揮了氨基酸和金屬離子的協(xié)同作用，因此生物活性增強(qiáng)，可見，復(fù)合氨基酸金屬配合物顯示出較大的藥用開發(fā)價(jià)值，有必要進(jìn)一步深入研究。