山西省運城市番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定

郝浩永， 滕紅梅， 劉 縉， 許瑞祥， 王 新

(1.運城學院理科實驗中心，山西運城 044000； 2.運城學院生命科學系，山西運城 044000)

番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus，簡稱TYLCV)是雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)病毒，主要依靠煙粉虱進行傳播。大多數菜豆金色花葉病毒屬病毒的基因組由雙組分組成，即DNA-A、DNA-B，大小為2.5～2.8 kbp，少數病毒為單組分，僅含有DNA-A[1-2]。目前國內發現的TYLCV大多為DNA-A，其基因組大小約為 2.8 kbp，有些單組分病毒還伴隨有衛星DNA[1]。TYLCV于1964年在以色列被發現并正式命名，隨后在短短幾十年時間內，迅速在世界各地蔓延，給番茄等農作物生產造成了巨大的損失[3]。2002年番茄黃化曲葉病毒病傳入我國上海[4]，之后在我國20多個省、市相繼發生，給番茄生產帶來了嚴重的威脅[5-7]。2010年，全國番茄種植面積超過20萬hm2，經濟損失達數十億元[8]。

有報道稱，2010年山西省運城市局部番茄田已出現了番茄黃化曲葉病毒病的危害[9-10]。2016年，筆者在運城學院新校區及周邊多處番茄種植地發現疑似感染番茄黃化曲葉病毒的植株，主要表現為葉片邊緣黃化、卷曲、植株矮化等癥狀。進一步調查發現，番茄黃化曲葉病毒病在運城市的多個番茄種植區都有發生，而且危害較嚴重，尤其是在夏季和秋季。由于運城市天氣干旱炎熱的時期較長，適合該病的傳播媒介——煙粉虱的生長和繁殖，因此對當地的番茄生產造成了極大的經濟損失。近年來，山西省運城市大規模煙粉虱暴發活動頻繁出現，2017年9月上旬運城市郊區甚至城區均出現大量煙粉虱。本研究的目的在于通過采集感病番茄植株樣品，對引起該病的TYLCV的DNA-A組分進行檢測和鑒定，以明確其DNA-A組分的基因組結構，了解發病原因和癥狀表現，以期為當地防治番茄黃化曲葉病毒病提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 感病樣品采集

疑似感染番茄黃化曲葉病毒的番茄病株于2016年8月采自山西省運城學院新校區，病株表現矮化、葉片黃化且嚴重上卷、落花等TYLCV侵染的典型癥狀，采集新鮮葉片直接用于總DNA的提取，或保存于-70 ℃備用。以健康植株作為對照。

1.2 番茄葉片總DNA的提取

采用十六烷基三甲基溴化銨法提取番茄葉片的總DNA，于-20 ℃保存備用[11]。

1.3 引物設計與合成

參照GenBank中已發表的TYLCV的序列，通過同源性比對分析，并參考文獻[12]，根據開放閱讀框(open reading frame，簡稱ORF)AC1和AV2保守區域，設計2對引物(P1F/P1R、P2F/P2R)。引物P1F/P1R用于擴增約2 450 bp的DNA片段，引物P2F/P2R用于擴增約550 bp的DNA片段。2個片段的重疊部分用于拼接，以獲得病毒DNA-A的全長序列。2對引物的序列如表1所示。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用簡并引物PCRc1/PBLv2040擴增可能存在的雙生病毒DNA-B組分[13]，利用通用引物β01/β02、UNA101/UNA102分別擴增可能存在的雙生病毒伴隨衛星DNAβ與DNA1全長序列[14-15]。

表1 引物序列信息

1.4 目的片段的擴增和序列測定

以提取的番茄植株葉片的總DNA作為模板進行PCR擴增，引物P1F/P1R和P2F/P2R所用的PCR反應體系相同，反應條件不同。PCR反應體系：1 μL DNA模板，2 μLTaqPlus DNA聚合酶(2.5 U/μL)，5 μL 10×TaqPlus Buffer，引物(100 μmol/L)各1 μL，10 μL dNTP Mixture(2.5 μmol/L)，加入ddH2O補足至50 μL。引物P1F/P1R的反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，7 2 ℃ 2 min，15個循環；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25個循環；72 ℃ 10 min。引物P2F/P2R的反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30s，35個循環；72 ℃ 5 min。

DNA-B、DNAβ、DNA1的PCR檢測參照文獻[13-15]完成。PCR擴增完成后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.5 序列拼接和分析

測序結果使用DNA Star Lasergene 7.1軟件中的Seqman程序進行拼接，用MegAlign程序進行序列相似性比較。用NCBI中的ORF finder程序查找ORF，采用軟件MEGA 6.0中的Clustal W方法進行多序列比對和鄰接(neighbor-joining)法構建系統進化樹，并進行1 000次Bootstrap檢驗。

2 結果與分析

2.1 PCR檢測結果

以病株樣品和健康番茄樣品提取的DNA為模板，利用引物P1F/P1R在病株樣品中擴增出大小約為2 450 bp的條帶，在健康植株中未擴增出(圖1)；利用引物P2F/P2R進行PCR擴增，從病株中擴增出大小約為550 bp的條帶，在健康植株中未擴增出(圖2)，與相關文獻報道[12]一致，確認本研究所采病株感染了番茄黃化曲葉病毒。DNA-B、DNAβ、DNA1在樣品中均未檢測到，推測感染的番茄黃化曲葉病毒可能是單組分病毒，且無衛星DNA伴隨。

2.2 病毒DNA-A的全長序列分析及其基因組結構特征

將長短2條目的條帶的測序結果用軟件DNA Star Lasergene 7.1進行拼接，最終得到1個長2 781 nt的單鏈環狀DNA，即DNA-A組分，將其命名為SXYC-X4，GenBank序列號為KY499720。SXYC-X4具有菜豆金色花葉病毒屬病毒基因組的典型特征：有6個ORF，其中AV1、AV2位于病毒鏈上，AC1、AC2、AC3、AC4位于其互補鏈上；AV1(308～1 084 nt)編碼病毒的外殼蛋白(coat protein，簡稱CP)，AV2(148～498 nt)編碼RNA沉默抑制子和運動蛋白，AC1(1 542～2 615 nt)編碼復制相關蛋白(replication-associated protein，簡稱Rep)，AC2(1 226～1 633 nt)編碼轉錄激活蛋白(transcriptional activator protein，簡稱TrAP)，AC3(1 081～1 485 nt)編碼復制增強蛋白(replication enhancer protein，簡稱Ren)，AC4(2 171～2 464 nt)編碼復制或轉錄調控因子；在AC1和AV2之間有1個313 nt的基因間隔區(intergenic region，簡稱IR)，為非編碼區，該區含有保守的九核苷酸序列TAATATT/AC(2 775～2 nt)的莖環結構、TATA box(2 675～2 678 nt)[16]及正向重復序列ATCGGTGT(2 653～2 660 nt，2 661～2 668 nt)。

2.3 病毒DNA-A與其他TYLCV的 DNA-A的同源性分析

將SXYC-X4的全長序列通過Blast進行比對分析，結果顯示，其與山東省濰坊市的病毒分離物TYLCV-SDWF-L7(KC999850)、河南省焦作市的病毒分離物TYLCV-HNJZ-19(KX034543)的同源性較高，均為99.5%。在AV1、AV2、AC1、AC2、AC3、AC4核苷酸序列同源性方面，SXYC-X4與TYLCV-SDWF-L7相比較同源性分別為99.2%、99.7%、99.7%、99.0%、99.5%、99.3%，SXYC-X4與TYLCV-HNJZ-19相比較同源性分別為99.1%、99.7%、99.5%、99.3%、99.5%、99.3%。從GenBank上選取25個具有代表性的雙生病毒序列進行比對，由表2可知，SXYC-X4與這25種雙生病毒的DNA-A全序列同源性為76.8%～99.5%，IR區為61.5%～99.7%。推導AV1、AV2、AC1、AC2、AC3、AC4編碼的蛋白質氨基酸序列的同源性分別為77.3%～99.2%、72.2%～100.0%、69.5%～99.4%、62.7%～98.5%、70.1%～99.3%、32.9%～97.9%，其中AV1氨基酸序列的變異最小，AC4氨基酸序列的變異最大。

2.4 病毒DNA-A與其他雙生病毒的系統進化分析

為進一步明確SXYC-X4的系統進化關系及分類地位，將SXYC-X4與表2中25個雙生病毒的核苷酸序列構建系統進化樹。由圖3可知，SXYC-X4與國內的TYLCV-SDWF-L7、TYLCV-HNJZ-19、TYLCV-YN4412、TYLCV-LNJZ等的親緣關系較近，形成1個獨立的分支A，再與澳大利亞的TYLCV-AU-1923、美國的TYLCV-USA及國內其他分離物形成1個較大的分支B，與所有番茄黃化曲葉病毒則形成1個更大的分支C；而與番茄曲葉病毒、南非木薯花葉病毒、東非木薯花葉病毒、煙草曲莖病毒等的親緣關系相對較遠。據報道，通常雙生病毒IR區的變異最大[1，7，12，17]，而本研究中AC4氨基酸序列相似性變異大于IR區(表1)，SXYC-X4與TbCSV-India的同源性高于屬TYLCV的TYLCV-Oman-Tom-30、TYLCV-Sweden、TYLCV-Mild-Japan，然后分別基于IR區和AC4氨基酸序列作系統進化分析。由圖4可知，基于IR區，SXYC-X4與TYLCV-AU-1923、TYLCV-USA、TYLCV-LNJZ等形成1個分支A，再與除TYLCV-Mild-Japan、TYLCV-Oman-Tom-30、TYLCV-Sweden之外的TYLCV形成1個較大的分支B。由圖5可知，基于AC4氨基酸序列，SXYC-X4與大部分的TYLCV形成1個分支A，所有TYLCV與TbCSV-India形成1個更大的分支B。

表2 SXYC-X4與25種菜豆金色花葉病毒屬病毒DNA-A及ORF的序列比對結果

注：TLCV代表煙草曲葉病毒；SACMV代表南非木薯花葉病毒；TbCSV代表煙草曲莖病毒；EACMV代表東非木薯花葉病毒；a代表核苷酸序列；b代表氨基酸序列；*代表無可比對區域。

3 討論與結論

通過對山西省運城市病毒分離物SXYC-X4基因組全序列進行分析，結果表明其具有雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬單組分病毒基因組的典型特征，與TYLCV-SDWF-L7、TYLCV-HNJZ-19的同源性較高，均為99.5%。與SXYC-X4全基因組核苷酸序列同源性大于89%的病毒均為TYLCV，而與同為雙生病毒的番茄曲葉病毒、南非木薯花葉病毒、東非木薯花葉病毒、煙草曲莖病毒等的同源性均小于89%。根據雙生病毒科病毒分類原則[17-20]，SXYC-X4應屬于TYLCV的一個株系。通過構建DNA-A全序列系統進化樹發現，SXYC-X4與屬TYLCV-Isreal株系[21]山東、河南、云南、遼寧等地區的分離物聚在一支，親緣關系最近(圖3)，因此筆者認為，SXYC-X4屬TYLCV-Isreal株系，這也是目前分布最廣的一個株系[22]。根據目前已報道的資料[14-15，23-28]來看，單組分雙生病毒通常伴有衛星DNA，但本研究未檢測到，SXYC-X4是否伴有衛星DNA仍須進一步研究確認。在圖3分支B中，僅有TYLCV-AU-1923、TYLCV-USA為國外分離物，且分離的時間較早(分別為2006年、2007年)，其余皆為國內分離物，分離時間較晚(2007—2016年)，推測可能由于種質資源交流及煙粉虱擴散致使TYLCV在山西省運城地區蔓延。在雙生病毒的各ORF中，最保守的是AV1基因，通常同一地區雙生病毒的AV1同源性相當高[29-31]。本研究中，SXYC-X4與來自世界各地25種雙生病毒的各ORF編碼的蛋白中，AV1編碼的CP氨基酸序列的變異最小(77.3%～99.2%)，這進一步證實這種推測。

TbCSV也可感染番茄[32]，TYLCV與TbCSV可復合侵染煙草、番茄等作物，不同雙生病毒之間的重組經常發生[33-34]。RNA沉默是指多種真核生物體內發現的一種基于RNA水平的高度保守的特異性降解機制。RNA沉默的一種重要效應是防御病毒侵染。崔曉峰等發現，中國番茄黃化曲葉病毒Y10分離物在侵染本氏煙等寄主植物時，并未誘導明顯的癥狀，而煙草曲莖病毒Y35分離物單獨侵染則誘導曲葉等癥狀，病毒Y35的AC4蛋白是一個比Y10的AC4蛋白更強的RNA沉默抑制子，證明菜豆金色花葉病毒屬病毒的AC4蛋白與病毒致病性相關[35]。何自福等研究發現，來自同一地區的ToLCGDV-[G3]和ToLCGDV-[G2]同屬菜豆金色花葉病毒屬的成員，親緣關系最近，全基因組同源率為87.9%[29]。本研究發現，AC4氨基酸序列的變異最大(32.9%～97.9%)，TYLCV與TbCSV-India的進化關系在DNA-A全序列水平較遠，在IR區水平稍近，在AC4氨基酸序列水平最近，由此推測，自然界中TYLCV與TbCSV在AC4序列處可能已經發生了廣泛的重組，TYLCV有可能會獲得更強的致病性，應提高警惕。

番茄黃化曲葉病可由多種雙生病毒侵染引起，TYLCV是主要毒源，此病癥可能還由其他病毒復合侵染引起[21，36-37]。本研究目前只檢測了TYLCV，且發現SXYC-X4與TbCSV在AC4氨基酸序列上的同源性高于部分TYLCV，病株是否同時感染了其他病毒，仍須進一步檢測。

本研究從分子水平上鑒定了山西省運城地區引起番茄黃化曲葉病的病原，明確了病毒分離物DNA-A全長序列，分析了其在雙生病毒科中的分類地位及系統進化關系，為進一步利用全長序列構建侵染性克隆奠定了基礎，對山西省運城市當地番茄黃化曲葉病毒病的防治和番茄抗病育種工作具有重要的參考價值。