藍桿藻ATCC 51142中α-酮戊二酸脫羧酶的克隆與表達

謝琮琮， 許文武， 李至敏， 王小琴， 雷國風， 張 偉， 黃 婷， 李志敏

(1.江西農業大學生物科學與工程學院，江西南昌 330045； 2.江西農業大學理學院，江西南昌 330045)

藍藻，別稱藍綠藻或藍細菌，在藻類中是最簡單、最原始的單細胞原核生物，也是目前發現的最早的光合釋氧生物。藍桿藻ATCC 51142是一種白天進行光合作用，夜間通過固氮作用產氫的固氮型藍細菌[1]。由于在藍藻基因組中沒有檢測到α-酮戊二酸脫氫酶基因[2-3]，長期以來學術界一直認為藍藻沒有經典的三羧酸循環途徑。2011年Zhang等研究發現，在聚球藻PCC7002中a2770和a2771基因分別編碼α-酮戊二酸脫羧酶和琥珀酸半醛脫氫酶，這2個酶的存在使得藍藻的三羧酸循環變得完整[4]。實際上，編碼α-酮戊二酸脫羧酶和琥珀酸半醛脫氫酶的基因存在于除少數海洋藍藻外的大多數藍藻中[4]。

筆者所在研究組通過Blast序列分析，發現藍桿藻ATCC 51142中cce4227基因與聚球藻PCC7002中a2770基因的同源性達到81.8%，與集胞藻PCC6803中sll1981基因的同源性為76%。同樣，集胞藻PCC6803中sll1981基因編碼蛋白已被證明具有α-酮戊二酸脫羧酶功能[5-6]。因此本研究推測cce4227蛋白也具有α-酮戊二酸脫羧酶的功能。

近年來生物合成可再生燃料的研究吸引了越來越多研究者的關注[7]。其中，引人注目的是Genomatica公司的研究人員報道了基因工程大腸桿菌利用琥珀酸半醛生物合成1，4-丁二醇[8]。然而通過基因工程藍藻生物合成1，4-丁二醇的研究還未見報道。琥珀酸半醛正是α-酮戊二酸脫羧酶催化α-酮戊二酸非氧化脫羧生成的產物。因此對α-酮戊二酸脫羧酶開展研究將為未來利用藍藻生物合成1，4-丁二醇提供理論基礎。

本研究從藍桿藻ATCC 51142基因組中擴增得到cce4227基因，將其連接到pET28a載體上構建得到pET28a-cce4227質粒。將該質粒與pTf16分子伴侶質粒共轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞后得到表達菌株。搖瓶培養表達菌株經阿拉伯糖和異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導后純化得到cce4227重組蛋白。本研究為進一步闡明cce4227蛋白的催化功能及機制奠定了重要基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 試驗于2017年11月至2018年1月在江西農業大學生物科學與工程學院分子生物學實驗室完成。

pTf16分子伴侶質粒、大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞、表達載體pET28a為筆者所在實驗室保存；藍桿藻ATCC 51142基因組購于美國模式菌種保藏中心。

1.1.2 工具酶和主要試劑 限制性內切酶NdeⅠ、XhoⅠ、T4DNA連接酶、5K DNA Marker購于北京全式金生物技術有限公司；Protein Marker購于Thermo Scientific公司；2×Taq(Pfu)、2×TaqMix、普通DNA產物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購于天根生化科技(北京)有限公司；鎳離子親和層析樹脂(Ni-NTA)購于QIAGEN(凱杰)公司；所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；質粒測序由上海祥音生物科技有限公司完成；其他主要試劑均購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的PCR擴增 以藍桿藻ATCC 51142基因組為模板(1 μL，約30 ng)，加入上下游引物各1 μL(表1)，引物終濃度為0.2 μmol/L。加入2×Taq(Pfu)25 μL后加入滅菌水22 μL至總體積為50 μL。擴增反應條件：95 ℃預變性 3 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。反應結束后于4 ℃保溫。

表1 PCR引物序列

注：下劃線部分為酶切位點。

1.2.2 pET28a-cce4227重組質粒的構建與鑒定 將PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后回收，利用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切回收片段。用同樣的酶雙酶切pET28a載體。將雙酶切的基因片段cce4227和載體線性片段pET28a(基因片段與載體片段的物質的量之比為6 ∶1)在16 ℃金屬浴恒溫下用T4 DNA連接酶過夜連接。取連接產物10 μL轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(80 μL)后，用含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體平板培養基篩選陽性克隆。將經菌落PCR驗證正確的陽性克隆單菌落搖菌提取質粒后送檢測序。

1.2.3 cce4227重組蛋白的誘導表達 將重組質粒pET28a-cce4227和pTf16分子伴侶質粒共轉化BL21(DE3)感受態細胞(100 μL)，涂布于含卡那霉素(50 μg/mL)和氯霉素(25 μg/mL)的雙抗性LB固體平板培養基上，于37 ℃恒溫箱內倒置過夜培養，將其克隆單菌落PCR驗證為正確的陽性克隆菌進行誘導表達。將單克隆菌落加入10 mL含有卡那霉素(50 μg/mL)和氯霉素(25 μg/mL)的LB液體培養基中，于 37 ℃、180 r/min過夜培養。然后按0.5%接種量將過夜培養液加入1.2 L LB液體培養基(含有50 μg/mL卡那霉素、25 μg/mL 氯霉素和1 mg/mL阿拉伯糖)中進行菌體擴大培養。待培養液D600 nm為0.6時冰浴后加入IPTG(終濃度為 0.2 mmol/L)于16 ℃、180 r/min繼續培養24 h。

1.2.4 cce4227重組蛋白的分離純化 將離心所得菌體用20倍體積的平衡緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH值為8.0)重懸，于冰水浴中超聲破碎32 min(超聲工作2 s，間歇8 s，有效功率為10%)。菌體裂解液于4 ℃、12 000 r/min離心1 h得到菌體上清液，經0.22 μm濾膜過濾后，將上清過Ni-NTA樹脂(事先用平衡緩沖液進行平衡處理)，然后用含咪唑的平衡緩沖液進行濃度梯度洗脫，分別收集每個濃度的流出液，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測目的蛋白。合并含有目的蛋白的洗脫液后，于4 ℃采用透析袋進行濃縮透析。

2 結果與分析

2.1 pET28a-cce4227表達載體的構建與鑒定

以藍桿藻ATCC 51142基因組為模板，經PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳后獲得約1.7 kb大小的DNA條帶，該基因片段與cce4227基因理論堿基數(1 653 bp)相吻合(圖1)。將雙酶切后的cce4227基因片段和pET28a載體線性片段(圖2)經T4 DNA連接酶過夜連接后轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，挑取陽性克隆搖菌后提取質粒。將該質粒進行DNA測序，測序結果表明，該基因序列與National Center for Biotechnology Information(美國國立生物技術信息中心)數據庫中的cce4227基因序列完全一致。因此可見，本試驗成功構建了pET28a-cce4227表達載體。

2.2 cce4227重組蛋白的誘導表達

將pET28a-cce4227表達質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，搖瓶培養菌液后經IPTG(0.2 mmol/L)誘導發現cce4227重組蛋白為包涵體，在上清液中沒有可見的cce4227重組蛋白(圖3)。因此本試驗將pET28a-cce4227質粒和pTf16分子伴侶質粒共轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞。菌落PCR研究發現，pET28a-cce4227質粒成功轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，即構建成功pET28a-cce4227/pTf16 BL21(DE3)(圖4中2、3、5、6條帶片段大小與cce4227基因片段大小相符合)。挑取圖4中2號單克隆菌落搖菌培養。結果發現，pTf16分子伴侶質粒的共表達明顯增加了cce4227蛋白的可溶性(圖3)。cce4227基因的堿基數為1 653 bp，編碼1個含有550個氨基酸殘基的蛋白質，其分子量為59.91 ku，與圖3中大小約為60 ku的條帶一致。

2.3 pET28a-cce4227/pTf16重組蛋白的分離純化

將含有目的蛋白的上清液用Ni-NTA親和層析柱純化。用含有20～200 mmol/L咪唑的緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH值為8.0)進行洗脫(圖5)。由于pTf16分子伴侶質粒表達的促發因子(trigger factor，簡稱TF)蛋白沒有組氨酸標簽，不能被Ni-NTA吸附。當咪唑濃度增加到40 mmol/L時，TF蛋白基本被洗脫，此時有少量cce4227重組蛋白被洗脫。當咪唑濃度提高到60 mmol/L時，大量cce4227重組蛋白被洗脫。然后用含有100 mmol/L咪唑的緩沖液將cce4227重組蛋白全部洗脫。合并圖5中含有cce4227重組蛋白的洗脫液后濃縮脫鹽，得到純度>95%的cce4227重組蛋白。菌體蛋白收率約為 12 mg/g 。

3 討論

本研究通過Blast序列分析發現，藍桿藻ATCC 51142中cce4227基因與集胞藻PCC6803中sll1981基因的同源性為76%[6]，與魚腥藻PCC7120中all3555基因的同源性為74%；藍桿藻ATCC 51142中cce4228基因與聚球藻PCC7002中a2771基因的同源性為68%，與魚腥藻PCC7120中all3556基因的同源性為71%[9-10]。重要的是藍桿藻ATCC 51142中cce4227蛋白與集胞藻PCC6803中sll1981蛋白的氨基酸序列同源性達86%，且sll1981蛋白已經被證實具有α-酮戊二酸脫羧酶的功能[5]，因此推測cce4227蛋白也具有α-酮戊二酸脫羧酶的功能。

本研究通過常規PCR技術從藍桿藻ATCC 51142基因組中成功克隆到cce4227基因，然后將其連接到pET-28a載體后轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，陽性單克隆菌落經測序正確后得到蛋白表達質粒pET28a-cce4227。雖然該表達菌株中cce4227重組蛋白的表達效果較好，但是其在上清液中的含量較低，大部分為包涵體蛋白。因此，將pET28a-cce4227質粒與pTf16分子伴侶質粒共轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞。研究發現，與分子伴侶蛋白(TF蛋白)共表達時，cce4227重組蛋白的可溶性得到提高，在上清液中有明顯可見的cce4227蛋白。經搖瓶培養后通過Ni-NTA親和層析方法獲得純度較高的cce4227蛋白，菌體蛋白收率達到12 mg/g。SDS-PAGE測得的cce4227蛋白分子量約為 60 ku，與cce4227蛋白的理論分子量(59.91 ku)比較接近。

筆者所在實驗室已有的試驗數據表明，在焦磷酸硫胺素作輔因子時，cce4227蛋白可以催化α-酮戊二酸轉化為琥珀酸半醛。當用pH值為7.5、濃度為100 mmol/L的HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖液時，cce4227蛋白對α-酮戊二酸的Km(米氏常數)為1.21 mmol/L，kcat(催化常數)為1.16 s。后續研究將對cce4227蛋白的詳細酶動力學參數及結構功能關系作進一步測定。