蒙古黃芪AFLP分子標記反應體系的建立與優化

姜志艷， 楊慧楠， 邵學勤

(內蒙古科技大學生命科學與技術學院，內蒙古包頭 014010)

蒙古黃芪[Astragalimembranaceus(Fisch.) Bge. var.Mongholicus(Bge.) Hsiao ]為豆科黃芪屬，是內蒙古特色藥用植物，具有很好的藥用價值和經濟價值。由于目前黃芪野生資源稀缺，大多進行人工栽培[1]。近些年來，對藥用植物黃芪的研究主要集中在其藥理活性成分分析、有效成分提取等[2]，而有關黃芪的利用分子標記輔助育種、數量性狀基因座(quantitative trait locus，簡稱QTL)定位、構建分子遺傳連鎖圖譜和進行黃芪種質遺傳多樣性研究的相關信息較少。

擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP)具有多態性高、DNA用量少、無需預知基因組序列信息、穩定性好等優點，該分子標記技術被廣泛應用于植物遺傳育種、種質資源研究[3]、遺傳多樣性分析[4-6]、構建遺傳圖譜(尤其是高密度分子圖譜)[7]及基因定位[8]等方面。目前，已有研究者利用簡單重復序列標記(simple sequence repeat，簡稱SSR)、隨機擴增多態性DNA標記(random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD)、相關序列擴增多態性(sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP)等分子標記技術對黃芪進行了遺傳多樣性研究，王敖利用SSR分子標記對蒙古黃芪進行了遺傳多樣性研究[9]，錢丹等利用SRAP分子標記技術分析了蒙古黃芪的親緣關系[10]。但目前尚少見有關藥用植物黃芪AFLP分子標記分析及反應體系相關研究的報道。為此，本研究以蒙古黃芪為試驗材料，對AFLP分析過程中的影響因子進行研究，建立優化黃芪AFLP分析體系。以期為從分子水平上對黃芪進行遺傳多樣性研究、遺傳連鎖圖譜構建、分子標記輔助育種等研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為蒙古黃芪，黃芪幼葉于2017年7月采集于包頭醫學院內蒙古特色藥用植物繁育種植基地。-80 ℃保存備用，黃芪組培苗于室內培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取及檢測 對黃芪單株葉片進行DNA的提取，黃芪基因組DNA提取采用植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的純度和完整性，用紫外可見分光光度計測定DNA的濃度和純度，保存于-20 ℃冰箱。

1.2.2 基因組DNA的酶切-連接 使用限制性內切酶EcoRⅠ與MseⅠ(購自NEB)對黃芪基因組DNA進行雙酶切，同時加入EcoRⅠ/MseⅠ接頭，用T4DNA連接酶進行連接作為預擴增模板，酶切-連接一步完成。反應總體積為 20.0 μL，含樣品DNA 2 μL(50 ng/μL)，EcoRⅠ 0.2 μL (15 U/μL)，MseⅠ0.3 μL(10 U/μL)，BSA 0.3 μL(10 mg/mL)，EcoRⅠ/MseⅠ(5 μmol/μL)接頭各0.4 μL，10×NEB reaction buffer 2.0 μL，10 mmol/L ATP 0.4 μL，T4連接酶(350 U/μL)0.8 μL，加ddH2O補足總體積至20.0 μL。分別設定酶切-連接時間為12、14、16 h，37 ℃溫浴。取出后保存于-20 ℃冰箱。

1.2.3 AFLP模板DNA的預擴增 反應總體系為20.0 μL，包括酶切-連接產物4.0 μL，10×PCR-buffer 2.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，dNTPs(2 mmol/L)1.8 μL，引物E00(5′-GACTGCGTACCAAT TCA-3′)、M00(5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′)(各 50 μmol/L)，用ddH2O補足總體積至20.0 μL，離心混勻進行PCR反應。PCR擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保溫。

1.2.4 AFLP模板DNA的選擇性擴增 選擇性擴增反應采用表1中E3/M3引物組合將預擴產物分別稀釋10、20、30、40倍進行選擇性擴增。反應總體系20.0 μL，包括稀釋預擴增產物2.5 μL，10× buffer(含Mg2+)1.5 μL，dNTPs(2 mmol/L)2.0 μL，Taq酶(5 U/μL)0.15 μL，選擇性引物(50 ng/μL) 各1.0 μL，用ddH2O補足總體積至20.0 μL。PCR擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，13個循環，每個循環的退火溫度下降0.7 ℃；然后 94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，26個循環；每個循環增加1 s，最后 72 ℃ 10 min。

表1 篩選AFLP分子標記的引物序列

1.2.5 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染 在PCR產物中加入1/3體積的變性劑，95 ℃變性5 min，于6%變性聚丙烯酰胺凝膠中，恒定功率70 W，預電泳30 min，上樣量為6 μL，電泳2 h后，進行顯色、掃描膠板。

2 結果與分析

2.1 黃芪基因組DNA提取質量的檢測

中藥植物高質量基因組DNA的提取對其后續試驗的進行發揮著極為重要的作用。植物基因組DNA的提取受植物的組織材料、部位、形態特征等影響，例如有的中藥植物中含有多糖、酚等次生代謝物會直接影響DNA提取的純度，所以需要根據試驗材料的實際情況，科學、合理地采用DNA提取方法。本研究采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[5]，從含多糖、酚的蒙古黃芪中簡便、快速地提取DNA，為分子遺傳標記應用于黃芪的種質資源研究提供基礎[2]。

由圖1可見，提取的黃芪基因組DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶明亮，無脫尾彌散現象，無RNA條帶，提取的基因組比較完整，用紫外可見分光光度計檢測D260 nm/D280 nm值都在1.8～2.0，可用于黃芪AFLP分析。

2.2 酶切、連接體系的優化

本研究對黃芪基因組進行酶切連接采用了多種試驗方法，關于限制性核酸內切酶組合EcoRⅠ/MseⅠ、PstⅠ/MseⅠ的選擇與酶切、酶連分步法和一步法均有報道[11]。經多次試驗比較，最終確立本試驗中AFLP體系的建立采用EcoRⅠ/MseⅠ雙酶切，酶切-連接一步完成，試驗對酶切連接時間作了不同設置，處理時間為12、14、16 h(圖2)。得出最佳的酶切-連接時間為16 h。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切-連接時間為16 h的產物在100～1 500 bp范圍內出現均勻、清晰的彌散帶，證明酶切徹底，可以為AFLP研究提供理想的模板，試驗時間得到了縮減，試驗效率得到了提高。

2.3 預擴增產物的稀釋倍數

預擴增反應是以酶切-連接產物作為模板，用引物 E0/P0 進行預擴增，在進行選擇性擴增之前，預擴增產物需要進行一定量的稀釋，本研究中將預擴增產物稀釋倍數分別設為5、10、15、20、25、30、40倍，經瓊脂糖凝膠電泳檢測可知，不同稀釋倍數的模板即模板濃度對擴增效果并無明顯影響(圖3)，經過后續選擇性擴增試驗也證實了這一點，為保證選擴產物量的充分，最終確定將預擴產物稀釋20倍。

2.4 AFLP引物的設計與篩選

根據接頭序列互補原則設計選擇性擴增引物，選擇性擴增引物是在預擴增引物3′端隨機增加2個或3個選擇性堿基來進行設計的，在AFLP分子標記中的引物是隨機組合的，不同的引物組合成不同的引物對，用于選擇性擴增。本試驗中黃芪AFLP分析所用36對引物分別采用E/M引物“2+2”“2+3”“3+3”(數字2、3表示引物最后的堿基數)組合進行篩選得到。其中5對引物組合(E-AG/M-CGT、E-AT/M-CTG、E-GA/M-CAA、E-TC/M-CAA、E-GT/M-CTG)表現出多態性，多態性比率80.5%，詳見圖4、圖5。

2.5 銀染體系的優化

AFLP分子標記中需要進行大量的凝膠電泳試驗，凝膠電泳后膠板的顯色費時、費力，同時還會受到諸多因素的影響，如電泳電壓的高低、顯影液的溫度、銀染的時間、配制膠板的質量、試劑尿素質量的好壞等，都會對銀染結果產生影響。本試驗參考多種銀染方法，進行多次嘗試與改進，最終得到優化的銀染方法，用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、恒定功率為70 W，預電泳時間為30 min，預電泳時間不易過短，電泳時間為120 min。具體步驟如下：(1)固定。將玻璃板從電泳槽中取出，拔出梳子，輕輕將長板取下，放入2 L蒸餾水+20 mL冰乙酸+200 mL無水乙醇溶液中，輕輕搖動15～20 min。(2)漂洗。在2 L蒸餾水中漂洗2次，每次2～3 min。(3)染色。在2 L蒸餾水中加入4 g硝酸銀，染色15 min。(4)顯影。在2 L蒸餾水中加入60 g氫氧化鈉、10 mL甲醛顯影至條帶清晰為止。(5)中止。當條帶不再清晰時，將板取出放入最初配好的固定液中，中止2 min。(6)漂洗。在2 L蒸餾水中漂洗2 min，自然風干，拍照。

3 討論

黃芪作為內蒙古的特色藥用經濟植物，被廣泛應用在醫藥中，但目前野生黃芪資源稀缺，所以大多采用人工栽培的方法培育黃芪。近年來，國內外對黃芪的研究除藥理活性成分、有效成分提取外，開始從DNA分子水平上研究蒙古黃芪的道地性等并取得了一些進展，而對黃芪分子標記輔助育種、QTL定位、構建遺傳圖譜的研究則鮮有報道。本研究所探討的AFLP分子標記在黃芪上的應用，將會為蒙古黃芪遺傳多樣性研究、圖譜構建等奠定基礎。

本研究采用AFLP分子標記技術對蒙古黃芪進行分析，結果表明有一定的可行性，擴增條帶多、重復性好，為降低試驗成本、縮短試驗周期、提高試驗效率，在體系優化過程中，采用EcoRⅠ/MseⅠ對黃芪基因組DNA進行雙酶切，且酶切-連接采用一步法完成，AFLP分子標記雖然操作復雜、對試驗技術要求高，但目前仍是一種十分理想、有效的分子標記方法[11]。

對于某一種具體的試驗材料藥用植物黃芪來說，并不是所有引物對組合都是適宜的，所以大量的試驗工作是必須篩選出適合某種具體藥用植物的引物對。在進行大量的引物篩選過程中發現，不同引物對組合之間對于選擇性擴增反應結果差異很大，有的引物對擴增出的主帶多而清晰，差異條帶也多，而有的引物對擴增出的條帶數較少，有的引物對擴增出的差異條帶也很少等。本研究中應用選出的擴增條帶信號強、重復性好的5對引物組合對部分黃芪植株進行了分析。試驗結果表明，AFLP是標記效率最高的分子標記之一，但其技術操作復雜，影響因素很多，尤其是對該植物基因組信息了解得不是很清楚的情況下，一般選用該植物的同科近緣植物的AFLP引物進行篩選，是一種快速、有效的引物篩選方法。本試驗中所篩選的引物來自黃芪同科不同屬植物大豆。