植物根際促生細菌菌肥對新疆灰棗根際土壤解鉀效果及其與有機酸的相關性

朱舒亮， 劉勝亮， 李 靜， 楊 越， 楊文英， 李建貴

(1.新疆農業大學林業研究所，新疆烏魯木齊 830052； 2.新疆農業大學/新疆紅棗工程技術研究中心，新疆烏魯木齊 830052；3.新疆農業大學2612團隊，新疆烏魯木齊 830052)

植物根際促生細菌(plant growth-promoting rhizobacteria，簡稱PGPR)是在植物根際系統定殖、能夠明顯促進植物生長或抑制病原菌活動的一類有益細菌的總稱，具有普通土壤微生物的促進有機質分解與轉化、養分循環和吸收等作用[1-5]。

目前大量研究表明，PGPR能夠有效促進植物根部生長，為植物的生長提供營養需求。部分特定功能菌株通過生長代謝作用還可以活化微生物生態環境。植物對土壤有效營養成分的利用效率主要通過根部的生長和根表面積的增加來反映[6-8]。將PGPR制備的菌肥施入土壤后，在土壤微生物及土壤酶活性影響下能分泌產生大量有機酸，土壤pH值呈下降趨勢，通過不斷釋放出土壤中的氮(N)、磷(P)、鉀(K)，不僅能夠有效提高根系的抗逆性，還能改善土壤的理化性質[9]。因此，揭示以微生物、土壤、植物三者之間相互作用為核心內容的根際動態過程的作用機制，通過對根際生態系統的調控，提高水分、養分資源的利用效率，控制和減少環境污染，是提高作物產量和品質的一種新途徑，也將是未來生態農業生產一個新的發展方向[10-12]。

目前，人們在解磷菌和固氮菌的相關應用技術上已經有了較為成熟的方法和經驗，但在解鉀菌方面的技術較為薄弱，而耕作層土壤中含有大量固定態的鉀，隨著科學技術的發展，人們越來越注重對增加土壤鉀離子含量的需求?？茖W配比、合理施用鉀肥，以及補充土壤中的鉀素，已經成為農業領域研究的熱點[13-15]。

由于新疆地區地理條件特殊，土地普遍鹽堿成分含量較高，且新疆處于干旱半干旱地帶，這對于目前已有的大部分菌肥與制劑在農業上的應用產生了制約。因為微生物普遍對于生存環境較敏感，且具有一定的專一性。由于針對新疆地區特殊環境土壤的解鉀機制研究相對較少，所以，根據新疆地區獨特的氣候條件和土壤環境及灰棗的營養需求，加上對解鉀細菌特性的了解，筆者用分離篩選的4株高效解鉀菌進行田間試驗，進一步分析菌株分泌的有機酸對釋放土壤中速效鉀的效果，不僅可以提高鉀肥利用率，還能切實緩解我國對鉀肥產生的供應與需求之間的矛盾，改良鹽堿地土壤肥力，保障農業生產，維持作物高產，降低對化肥的使用量與對環境的污染性，進而保護我國農業生態環境，對發展有機、生態、低碳農業，以及保證糧食安全具有極其深遠的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗地概況 新疆庫爾勒位于我國西北地區(地理位置85°12′～86°27′E，41°14′～42°14′N)，由霍拉山、天山形成了庫爾勒的北部屏障，南部為著名的塔克拉瑪干沙漠，可謂地理位置險峻，是連接南北疆的樞紐。庫爾勒地區屬于溫帶大陸性氣候，光照條件充足，早晚溫差較大，且降水量稀少，該地區適合喜溫植物的種植生長。

試驗地位于庫爾勒市東北方位25 km處的新疆農業大學林業研究所博湖南山試驗基地棗樹果園中，土壤質地為沙壤土，日照時數為2 990 h，年平均降水量為58.6 mm，年平均溫度為12.1 ℃，土壤堿解氮含量為33.36 mg/kg，速效磷含量為16.34 mg/fig，速效鉀含量為55.36 mg/kg。土壤結構較為多樣，其中沙壤土雜質較多，有機物、P、K含量普遍不高。

1.1.2 供試菌株 本田間試驗供試菌株為新疆農業大學林業研究所微生物實驗室經篩選得出的解鉀能力較強的解鉀菌4株：K3、K7、K11、K24。

1.1.3 供試作物 供試果樹為六年生灰棗樹，并選擇東西方向種植，且樹齡、樹干直徑、樹形一致的作為試驗處理小區樣株，樣株的種植密度(株行距)為1.5 m×2.5 m。

1.1.4 室內擴繁培養 牛肉膏蛋白胨培養基配方：3.0 g牛肉膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，18.0 g瓊脂，pH值為7.0～7.2，1 000 mL蒸餾水。

對于經過分離鑒定的解鉀菌株，取冷凍保存的菌種，經過復蘇活化，在無抗平板上劃線，重復3次，于恒溫培養箱培養24 h后，挑選培養皿內培育的優勢單菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在30 ℃、180 r/min環境中擴繁培養，擴繁培養在室內無菌條件下進行。

1.2 田間試驗設計

1.2.1 田間試驗設計 本試驗采取隨機區組的試驗方法，以保證試驗的可靠性，共設置3個處理，處理1：各供試菌劑(K3、K7、K11、K24)+基肥；處理2：未接菌空白培養基+基肥；處理3：清水+基肥。2個對照為CK1(空白培養基)與CK0(清水空白)。

1.2.2 試驗小區及重復設計 試驗成年果樹選擇樹齡相同、果樹株形與產量相對一致，且土壤地力差異性相對較小的果園地塊，共有6個處理，分別為處理1(K3菌株)、處理2(K7菌株)、處理3(K11)、處理4(K24菌株)、處理5(空白培養基對照)、處理6(清水空白對照)。每個處理各設3個平行試驗小區，每個小區各種4株果樹，合計18個試驗小區，共72株灰棗果樹，各個處理區組采用長方形隨機排列，最好做到單灌單排，避免邊際效應和各個處理間的相互影響。

1.2.3 灌根及回收采集 本試驗于2016年4月底在灰棗果園中進行，各處理菌液采用穴施法按200 mL/株澆施，澆施前用清水將原液稀釋到1 000 mL，施入棗樹正東方向(距樹干10～15 cm，土層深度為30 cm)，空白對照處理加入無菌空白液體培養基，而清水對照加等量清水。施菌后0、30、60、90、120 d采集土壤樣品，并將回收后的土壤風干，進行速效養分含量的測定。

1.3 土壤養分測定

對于試驗用地取回的土樣，土壤微生物相關測定選用新鮮土樣，其他一般分析項目都采用風干土樣。

1.3.1 土壤活菌數的測定 在本試驗中用稀釋平板法進行活菌數量的測定，雖然可以測定根際土壤中的活菌數量，但是因為田間試驗具有較多不可控性并受諸多因素制約，單純地使用計數結果不能準確無誤地反映微生物的實際數量，因此，為了降低測定的誤差，對于采集的土壤樣品稀釋液每次都需要經過充分的振蕩以保證混勻[16]。

在無菌環境下取根際土壤并稱量(10 g)后，一同溶于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，于28 ℃恒溫振蕩30 min，使微生物細胞充分分散。取0.5 mL 10-1稀釋液與4.5 mL無菌水混勻，即得10-2稀釋液；再取0.5 mL 10-2稀釋液與4.5 mL無菌水混勻，即得10-3稀釋液，將所制備的稀釋液均勻地涂布在含有利福平(300 μg/mL)的牛肉膏蛋白胨平板上，重復3次。在恒溫培養箱中于28 ℃培養2 d后進行計數，培養結束后取出培養平板，對各個試驗組的菌株發育情況進行統計分析，對相同濃度培養皿上的有效菌落數量進行計數。

1.3.2 土壤速效鉀含量的測定 土壤速效鉀含量測定方法：將采集的土樣風干后，經1 mm篩孔過濾后稱5 g土樣，倒入浸提瓶中，加1 mol/L乙酸銨溶液定容至50 mL，給浸提瓶口封膜加蓋后，于水浴恒溫振蕩器中振蕩30 min，用干濾紙進行雜質過濾，將濾液提取至試管中，各處理重復3次，使用火焰光度計測定速效鉀含量。

1.3.3 土壤有機酸含量的測定 土壤有機酸含量測定采用高效液相色譜法(HPLC)，用U3000高效液相色譜儀測定，色譜條件：C18色譜柱，250 mm×4.6 mm；流動相：99% 0.02 moL/L KH2PO4和1%甲醇(用H3PO4調節pH值至 2.6)，流速：0.5 mL/min，進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。樣品處理：取10 mL發酵液樣品于離心管中，在離心機中于 4 000 r/min 離心10 min，離心后經0.22 μm濾膜過濾，將濾液在超聲波清洗器上振蕩后，測定有機酸含量，重復3次。因有機酸分泌有時間的滯后性，所以施菌后1d開始采樣檢測灰棗根際土壤內有機酸含量。

1.3.4 土壤pH值的測定 土壤pH值的測定方法：將采集的土樣風干后經1 mm篩孔過濾，稱取 20 g 土樣，倒入浸提瓶中，加入蒸餾水定容至50 mL，于水浴恒溫振蕩器上振蕩 3 min，用酸度計測定pH值，重復3次。

1.4 數據分析

試驗數據整理使用Excel 2003，數據分析采用SPSS 19.0。

2 結果與討論

2.1 不同濃度有機酸對礦物鉀釋放的影響

土壤的肥力與土壤供給植物生長發育的營養元素都與土壤養分有著直接關系[17-18]。在研究不同菌劑對灰棗根際土壤微生物數量的影響中，測得的土壤微生物菌落數是1個生長周期的平均值。由表1可以看出，微生物菌株處理組在剛澆灌菌液(0 d)時，菌落數在1.0×1010CFU/g以上；在澆灌菌液30 d時，菌落數量降至1.0×107CFU/g以下；在澆灌菌液60～90 d時，菌落數維持在1.0×108CFU/g數量級，可見菌落數量變化不大，但4株菌株具有不同強弱的定殖效果；到澆灌菌液120 d時，菌落數量略有下降。其中K7菌株制備的菌液對土壤中的微生物數量具有較為平穩和較強的增益效果，其他幾種處理菌有不同程度的表現。

2.2 PGPR對灰棗根際土壤中有機酸含量的影響

采用高效液相色譜法測定混合有機酸的標樣，從而對土壤中有機酸含量進行測定。由表2可以看出，不同菌肥施菌后經過1 d分泌有機酸，與清水對照處理(CK0)對比后可以看出，施菌前土壤中的有機酸含量與施菌后無明顯差異，土樣中基本沒有檢測出有機酸含量；在施菌液30 d時，3種有機酸含量多數到達分泌的峰值， 土壤中丙酮酸的含量變化較為明顯，其中K7菌株的丙酮酸濃度達4.018 mg/kg，乙酸與檸檬酸在部分處理下均有增加，在隨后的60 d時逐漸下降，在90、120 d時趨于平穩。說明土壤中分泌有機酸是有一個動態的變化趨勢的，與速效鉀含量變化趨勢相結合分析，說明土壤中的有機酸含量對含鉀礦物產生溶解釋放作用，并增加了土壤中植物可吸收利用的速效鉀含量。

表1 根際土壤微生物菌落計數

表2 根際土壤中的有機酸含量

2.3 PGPR對灰棗根際土壤中速效鉀含量的影響

由表3可知，在施入菌液1 d后，各菌劑處理組土壤中的速效鉀含量均高于對照組且與CK0之間差異顯著(P<0.05)，其中K3菌株的速效鉀含量達到了112.75 mg/kg，比清水對照的速效鉀含量高 45.2 mg/kg，各處理速效鉀含量比清水對照高40.39%～66.91%。在施入菌液30、60 d時，各處理土壤中的速效鉀含量均不同程度地高于對照，其中K7、K24菌株對土壤中速效鉀含量提升效果顯著；在施入菌液90 d 時，K3菌株速效鉀含量最高，其余菌株處理土壤中的速效鉀含量趨于平穩，并接近對照。

觀察土壤中活菌數量可知，雖然活菌數量已有下降趨勢，但土壤中的PGPR仍具有一定的解鉀效用，因此可見，試驗土壤中的速效鉀含量并沒有隨著活菌數的減少而下降，而且還有部分小區出現了速效鉀含量提高的現象。到施用菌液 120 d 時，隨著果實成熟期的到來，果實細胞分化，果實體積逐漸增大，土壤中的速效鉀逐漸流入棗果中，此時土壤中的速效鉀含量降低。說明在一定程度上，施用微生物菌液可以提高土壤中速效鉀的供給能力，施菌后1 d K24菌株對速效鉀含量的提升能力最佳，較CK0含量高37.24 mg/kg。

2.4 PGPR對灰棗根際土壤中pH值的影響

由圖1可以看出，土壤中的pH值隨著時間的推進有一個動態的變化趨勢，因為菌株在發酵液中分泌有機酸，使得菌液pH值呈酸性，在施菌后1 d的土壤中的pH值最低。并且空白對照培養基的pH值初始為7.0～7.2，所以對比清水對照，也有一定差異。在30 d時，土壤中pH值提高，說明根際土壤吸收PGPR菌肥，相比CK產生一定的差異，在施菌后60、90 d時，pH值開始逐漸下降，其中K24菌株處理土壤pH值的變化明顯。在施菌后120 d時，pH值有所升高，說明PGPR經過生長代謝產物，改善了鹽堿土地的酸堿度，作用于生長期內，但是隨著時間的變化，PGPR對土壤中pH值的改良功效有所減弱。

3 結論

本研究將制備的微生物菌液進行田間試驗，定期采樣并測定土壤中的速效鉀含量與有機酸種類、含量，進一步分析有機酸對轉換土壤中鉀離子形態的作用。主要研究結果如下：

(1)通過對統計結果的分析可知，不同菌劑處理微生物菌落數量均高于清水對照，在施菌后明顯高于清水對照，之后進入一個動態變化過程，其中K7菌株制備的菌液對土壤中微生物數量具有提高且平穩的效果。

表3 不同處理根際土壤中的速效鉀含量

注：同列數據后標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

(2)通過前期對有機酸標樣的測定，定期采樣檢測土樣后發現，因為田間試驗的不可控因素過多，有機酸含量普遍偏低，提取其中含量高的3種有機酸——丙酮酸、乙酸、檸檬酸進行動態跟蹤。3種有機酸含量多數在施菌后30 d時達到最高值，隨后逐漸下降并趨于平穩。其中丙酮酸中K7菌株處理的濃度在施菌后30 d時最高，達4.018 mg/kg。

(3)不同菌劑施入后的土壤都具有提高土壤中鉀離子釋放量的作用，速效鉀含量均明顯高于對照，其中K3菌株處理的土壤中速效鉀含量達到了112.75 mg/kg，比CK0的速效鉀含量高45.2 mg/kg，不同菌株處理的速效鉀含量比CK0提高了40.39%～66.91%。K7、K24菌株處理與對照相比，在30、60 d時對土壤中速效鉀含量的提升效果明顯，K24菌株處理對土壤中礦物鉀的釋鉀能力最佳，施菌后1 d較清水對照含量高37.24 mg/kg。K3菌株處理在90 d時解鉀量最高，隨后降低并趨于平穩。

4 討論

本研究結果表明，經過1個生長期內的動態測定，施用PGPR菌肥處理使得棗樹根際土壤中的速效鉀含量、有機酸含量、微生物數量比只施用常規化肥的對照明顯提高，但是由于田間試驗的不可控性，有機酸的含量普遍偏低。土壤中接種PGPR可以顯著地改善作物的鉀素營養，釋放生長養分，改良土壤品質，調節土壤生態系統平衡[19-21]，其解鉀作用與生長代謝過程中所產生的有機酸種類與含量密切相關。因為不同解鉀菌株特性存在差異，導致在生長代謝過程中產生的有機酸濃度、種類相差較大，所以不同高效解鉀菌之間在對鉀的活化能力上也存在較大差異[22]。

當植物根際土壤中的有機酸含量較低時，有機酸的種類將在一定程度上決定對土壤中難溶性或不可溶性鉀的活化作用。丙酮酸、乙酸、檸檬酸在土壤中含量最高，對含鉀礦物中的鉀離子釋放也起到較為重要的作用。

綜上所述，不同菌株處理與只施用常規化肥的對照相比，施用了PGPR對土壤的肥力提高明顯，從而進一步論證了PGPR可改良土壤環境、促進植物對土壤養分的吸收利用[23-24]。PGPR中的有機酸可有效地促進礦物鉀的分解釋放，但有機酸對含鉀礦物的釋鉀是一個既緩慢又持續的綜合動態過程，含鉀礦物的釋鉀量既受有機酸種類的影響，也與其濃度影響關系密切。由于微生物自身的局限性以及植株對養分變化表達的滯后性，需要增加試驗點擴大試驗并對樣本進行連續觀測，以期建立更完善的數據體系。進一步的研究將有可能更深入地揭示與闡明高效解鉀菌的解鉀機制，這一點很值得關注。