灰樹花生理成熟期到出菇期生理生化初探

葉建強(qiáng)， 宋 冰， 李 玉， 付永平， 李 丹， 李長田， 王 菲， 徐安然， 孟靈思

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)/食藥用菌教育部工程研究中心，吉林長春 130118)

灰樹花[Grifolafrondosa(Dicks.) Gray]商品名別稱栗子蘑(中國河北省遷西縣)、舞茸(日本)[1]，具有很高的食藥價值[2-5]，素有“食用菌王子”之美稱[6]。目前，灰樹花在日本的銷量已僅次于香菇和金針菇，穩(wěn)居第3位[7]，在我國也是主要栽培珍稀食藥用菌之一[8]，在河北省遷西縣、山東省泰安市及浙江省慶元縣等地已形成區(qū)域特色產(chǎn)業(yè)[9]。

食用菌栽培過程分為培養(yǎng)過程及出菇過程。培養(yǎng)過程分為定植期、發(fā)熱期和生理成熟期[10]。生理成熟期能顯著影響食用菌的產(chǎn)量和效益。近些年，關(guān)于食用菌生理成熟期的研究不斷增多。以往的研究表明，不同食用菌擁有不同的較適應(yīng)的生理成熟期培養(yǎng)天數(shù)，如香菇(20～40 d)、白靈菇(30～60 d)、茶薪菇(20～25 d)、蟹味菇(30～35 d)、灰樹花(20～30 d)、杏鮑菇(7 d)、金針菇(2～5 d)、真姬菇(25～40 d)等[11]，但未有針對關(guān)于該階段的深入研究。灰樹花屬于中高溫型菌[12]，出菇溫度和發(fā)菌溫度基本一致，可以減少其他因素的影響。雖然已有關(guān)于灰樹花栽培過程中胞外酶等方面的報道[13-14]，但都沒有進(jìn)入該階段的深入研究。本試驗(yàn)以主要栽培料硬雜木木屑、麥麩、輕質(zhì)碳酸鈣等為栽培培養(yǎng)基[15]，研究灰樹花生理成熟期到出菇階段的培養(yǎng)基質(zhì)量、含水量等生理生化變化，以期為灰樹花栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 灰樹花菌種 菌株號為H34，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心提供，來源于山東省泰安市。栽培料主料(硬雜木木屑)和輔料(麥麩、輕質(zhì)碳酸鈣)，均購自吉林省長春市農(nóng)博園菌菜基地。

1.1.2 培養(yǎng)基 配方：75%硬雜木木屑(主料)，23%麥麩(輔料)，2%輕質(zhì)碳酸鈣(輔料)，培養(yǎng)料含水量在62.5%左右，pH值自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 栽培試驗(yàn) 各料運(yùn)用烘干箱在105 ℃烘干30 min，測定含水量。按配方配比及含水量稱取各材料，加水拌至含水量為62.5%左右，采用33.00 cm×17.50 cm×0.05 cm聚丙烯袋裝濕料800.0 g(干料300.0 g)，袋口套直徑為2.5 cm的套環(huán)，插入直徑為2.5 cm、深12 cm的柱型塑料插棒，在 121 ℃ 滅菌85 min，冷卻至室溫，接種菌棒(拔出塑料插棒)，每袋接種10 mL液體菌種，蓋上透氣蓋，在23～26 ℃培養(yǎng)大部分顯現(xiàn)原基，轉(zhuǎn)入出菇室。出菇室管理如下：去掉透氣蓋及原基，搔菌出菇；溫度維持在19～21 ℃，濕度為93%～97%，二氧化碳濃度為400～700 μL/L，光照為200 lx/12 h，直到采收。

1.2.2 粗酶液的制備過程 在生理成熟階段到出菇階段，每5 d取樣1次，3次重復(fù)。取樣過程：菌袋開口，在栽培料下 2～3 cm處均勻取樣品，每份20.0 g左右，每天09：00隨機(jī)測量及取樣，樣品用液氮冷凍后，保存在-80 ℃冰箱中備用[16]。粗酶液提取：稱1.0 g樣品，其中1份加入2.0 mL蒸餾水，在28 ℃溫度下浸提4 h，過濾殘?jiān)? 000 r/min離心 10 min，取上清液，上清液即是粗酶液，保藏在4 ℃，每個樣品2次重復(fù)，分別備用。

1.2.3 生理測定方法 pH值采用手持式Testo 206酸度計(jì)測定[17]；菌袋失質(zhì)量等于上一次取樣階段質(zhì)量減去當(dāng)前取樣階段菌袋的質(zhì)量[18]；培養(yǎng)基干質(zhì)量測定方法參照王玉萬等的方法[19]；含水量測定采用105 ℃烘干法[20]；溫度差采用水銀溫度計(jì)測定菌料溫度，等于菌料中心溫度減去環(huán)境溫度；菌料單位面積壓力采用GY-4果實(shí)硬度計(jì)測量。

1.2.4 生化測定方法 羧甲基纖維素酶和濾紙纖維素酶活性測定參照Mandels等的方法[21]，淀粉酶活性測定參照李合生的方法[22]，羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶、淀粉酶酶活力單位定義為1 U=1 μmol葡萄糖/(60 min·g)干培養(yǎng)物；半纖維素酶活性測定參照Shamala等的方法[23]，酶活力單位定義為1 U=1 μmol木糖/(60 min·g)干培養(yǎng)物；漆酶、多酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶活性測定參照宋愛榮等的方法[24-25]，酶活力單位定義為1 U=ΔD/(30 min·g)干培養(yǎng)物。胞外可溶性蛋白含量測定采用lowry法[26]，應(yīng)用酪蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線；胞外可溶性糖含量測定采用二硝基水楊酸法[27]，使用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰樹花栽培特性

由表1可知，在灰樹花栽培過程中，菌袋在26 d左右滿袋，40 d左右部分菌袋套環(huán)口處顯現(xiàn)原基，40 d去掉套環(huán)及原基(生理后熟期顯現(xiàn))，搔菌出菇，54 d開始采收，到62 d采收結(jié)束，根據(jù)曾憲森等的報道[12]，該種屬于中高溫型菌種(17～26 ℃)。

本試驗(yàn)從生理成熟期到出菇期，共取8個時間點(diǎn)，分別是0、5、10、15、20、25、30、35 d，其中，0、5、10、15 d屬于生理成熟期，20、25、30、35 d屬于出菇期。菌袋移入出菇室時，為了控制整齊度及方便研究灰樹花出菇各階段，去掉套環(huán)及原基(生理后熟期顯現(xiàn))，搔菌出菇，各時期的狀態(tài)見表2。

表1 灰樹花生育理過程特性

表2 各取樣時間灰樹花的狀態(tài)

2.2 灰樹花生理特性變化

對灰樹花生理成熟期(0～15 d)和出菇期(15～35 d)的生理變化進(jìn)行分析，由圖1可知，菌料中含水量在0～5 d基本保持上升狀態(tài)，但5～10 d 明顯下降，可能由于原基形成，呼吸加快導(dǎo)致水分散失，進(jìn)入出菇期，15～30 d含水量不斷下降，且25～30 d下降明顯，可能與原基分化(此階段原基吐出大量白色水珠)有關(guān)，30～35 d含水量有略微升高。菌料的pH值在0～5 d緩慢降低，在5～15 d不斷升高，其中10～15 d 升高明顯，15 d達(dá)最高值，進(jìn)入出菇期，菌料的pH值基本保持下降，但20～25 d有小幅升高，表明原基形成過程中培養(yǎng)菌料的pH值會升高。

菌料中有縱橫交錯的菌絲，形成一個龐大的整體，能承受一定壓力，與菌絲量有一定相關(guān)性。由圖2可知，菌料單位面積承受的壓力在0～15 d不斷升高，其中在0～5 d明顯升高，其后變化不大，進(jìn)入出菇期，15～25 d不斷升高，20～25 d升高明顯，25 d達(dá)最高值，25～35 d不斷下降，其中25～30 d下降明顯。這與Montoya等報道菌絲量在該過程不斷升高到一定值[14，28]基本一致，但菌絲的韌性還與菌絲的內(nèi)含物及年齡有關(guān)，本研究表明在25～35 d單位面積壓力下降，可能是菌絲體把內(nèi)含物輸送到子實(shí)體中相關(guān)。菌料失質(zhì)量在0～5 d不斷降低，5～10 d明顯升高，可能與原基形成前代謝加強(qiáng)有關(guān)，10～15 d不斷下降，進(jìn)入出菇期，15～30 d 不斷升高，在30 d達(dá)到最大值，可能與割口出菇方式有關(guān)，30～35 d明顯減少，可能與灰樹花葉片生長可以接受到環(huán)境中高濕度水汽有關(guān)。菌袋的內(nèi)外溫度差變化反應(yīng)了菌料的代謝情況。溫度差在0～5 d緩慢下降，5～10 d明顯升高，可能與菌袋袋口出現(xiàn)原基有關(guān)，10～15 d溫度差維持在較高水平，進(jìn)入出菇期，15～20 d仍然維持在高水平，20～30 d明顯降低，30～35 d基本維持不變。

2.3 灰樹花胞外酶變化

從生理成熟期(0～15 d)到出菇期(15～35 d)，隨著培養(yǎng)時間的增加，灰樹花各個酶類活性有著不同的變化。

由圖3可知，纖維素降解酶類主要包括羧甲基纖維素酶和濾紙纖維素酶。其中，羧甲基纖維素酶活性在0～15 d基本呈下降趨勢，但5～10 d有細(xì)微上升，可能跟菌袋袋口出現(xiàn)原基有關(guān)，進(jìn)入出菇期，20～25 d有較高值。這表明原基形成時，羧甲基纖維素酶活性升高，也與Montoya等報道灰樹花羧甲基纖維素酶[14]基本一致。此外，濾紙纖維素酶活性進(jìn)入出菇期開始不斷上升，25 d有較高值，之后明顯下降。這表明濾紙纖維素酶活性在生理成熟期較弱，在出菇期大量分泌，且在原基分化時有最大值，這與倪新江等報道濾紙纖維素酶活性比纖維素酶及半纖維素酶活性微弱[13]相一致，且在出菇期變化與本試驗(yàn)一致。半纖維素酶活性在0～5 d略微下降，5～15 d明顯上升，進(jìn)入出菇期，基本維持在較高水平，但20～25 d明顯下降，這可能與原基分化有關(guān)。淀粉酶活性在0～15 d基本不斷升高，但5～10 d有細(xì)微下降，可能與菌袋袋口出現(xiàn)原基有關(guān)，進(jìn)入出菇期，15～20 d 快速上升，20 d時達(dá)最大值，可能與菌絲恢復(fù)相關(guān)，但20～30 d明顯下降，30～35 d又上升。淀粉酶活性在生理成熟期與倪新江等的報道[13-14]不一致，可能是與本試驗(yàn)選的高溫菌種有關(guān)，但在出菇期基本一致，表明灰樹花出菇時，淀粉酶活性不斷降低。

木質(zhì)素降解酶類主要是漆酶，與漆酶相關(guān)酶包括漆酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶和多酚氧化酶[29-30]。由圖4可知，3種酶的活性在 0～35 d基本是不斷降低的，在10、25、35 d均有高峰值。這表明木質(zhì)素降解酶類酶活性在生理成熟期和出菇期低，無太大相關(guān)性，與倪新江等研究報道漆酶類變化[13-14]基本一致。但木質(zhì)素降解酶類酶活性在原基形成時，酶活性會有一定提高，表明原基形成與木質(zhì)素降解酶類有一定正相關(guān)性，這與姜性堅(jiān)等報道在白色茶樹菇栽培過程中原基形成及分化時漆酶顯著升高[31]相一致。

2.4 灰樹花胞外可溶性蛋白含量和胞外可溶性糖含量變化

由圖5可知，胞外水溶性蛋白含量在0～5 d不斷升高，5～35 d 變化輕微，其中15～20 d有明顯下降，這可能是由于菌絲恢復(fù)生長需要蛋白，導(dǎo)致胞外蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)建細(xì)胞生長。胞外可溶性糖含量變化，在0～15 d基本是不斷下降的，但在 5～10 d有細(xì)微上升，可能跟原基形成有關(guān)，進(jìn)入出菇期，在20 d有較大值，20～35 d不斷下降，可能與菌絲恢復(fù)期菌絲量變多有關(guān)。這與Montoya等研究報道菌料還原糖變化趨勢[14，28]基本一致，但本試驗(yàn)中出菇期開始時胞外可溶性糖含量突然升高，可能與本試驗(yàn)搔菌出菇時菌絲恢復(fù)生長相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究了中高溫型灰樹花在栽培過程中從生理成熟期到出菇期的生理生化變化，pH值、漆酶相關(guān)酶活性不斷下降，但都在出現(xiàn)原基時明顯升高，這與在白色茶樹菇原基形成時，漆酶活性升高[31]相似；含水量在生理成熟期基本呈不斷升高的趨勢，在出菇期不斷下降，原基分化時下降，這與在黑木耳[32]和真姬菇[18]栽培中生理成熟期菌料含水量不斷升高相似；菌料單位面積壓力在生理成熟期不斷升高到一定水平，在出菇期的原基形成時明顯升高，達(dá)到最大值，后不斷降低；菌料失質(zhì)量在生理成熟期較低，在出菇期明顯升高，到原基形成及分化后明顯降低；溫度差在生理成熟期先降低，后升高到一定值(原基顯現(xiàn))，維持到出菇期菌絲恢復(fù)，之后明顯降低；濾紙纖維素酶活性在生理成熟期酶活性較低，在出菇期明顯升高，在原基分化時達(dá)到最大值；羧甲基纖維素酶活性在生理成熟期降低到穩(wěn)定值，在出菇期明顯升高，原基形成后不斷降低，這與倪新江等報道灰樹花中[13]類似；淀粉酶活性在生理成熟期不斷升高，在出菇期維持在較高水平，但在原基形成時降低；半纖維素酶活性在生理成熟期不斷升高，到出菇期菌絲恢復(fù)時達(dá)到最大值，后不斷下降，采收時又升高；胞外可溶性糖含量在生理成熟期維持較高水平，在出菇期不斷降低，與Montoya等研究報道菌料還原糖在生理成熟期維持較高，出菇期下降的變化[14，28]相同；胞外可溶性蛋白含量在生理成熟期不斷升高到一定水平，在出菇期菌絲恢復(fù)時降低，后又升高到穩(wěn)定水平。

因此，本試驗(yàn)結(jié)果表明不同指標(biāo)變化趨勢不完全相同，同一指標(biāo)不同時期變化也不完全相同。菌料的單位面積壓力、羧甲基纖維素酶活性、胞外可溶性蛋白含量在生理成熟期間(原基形成前)能到達(dá)一定水平，是否可以應(yīng)用于生理成熟期判斷還須進(jìn)一步研究；pH值和漆酶相關(guān)酶與原基形成有一定正相關(guān)，這對灰樹花原基形成研究具有積極意義，同時為灰樹花栽培過程中的生理成熟期及出菇管理提供理論依據(jù)。