16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的構建及其穩定性研究

陳 琳， 管遠紅， 黃東璋， 齊富剛， 魏冬霞， 陳瀛川， 張 歡， 王亞南， 蘇哲君，張洪濤， 區卓麟， 陳冬冬， 吳懷秀， 于淼淼， 楊雨秋

(江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州 22530)

抗耐藥菌感染已成為世界性難題，研究細菌耐藥機制，針對耐藥機制尋求新的抗感染藥物，尋找一些增強或保護現有抗菌藥物抗菌活性的物質，已成為抗感染治療尤其是抗耐藥菌感染治療的一個重要研究方向。

16S rRNA甲基轉移酶是近年來出現的一種介導臨床菌對氨基糖苷類抗生素尤其是對4，5-及4，6-二脫氧鏈霉胺類氨基糖苷抗生素高度耐藥的核糖體RNA甲基轉移酶[1]。編碼16S rRNA甲基轉移酶的基因大多位于質粒、轉座子、整合子、插入序列共同區等可動遺傳因子上，具有易于傳播和擴散的特點[2-5]。目前，幾乎世界各地均有16S rRNA甲基轉移酶耐藥臨床菌出現的報道，且有不斷增多的趨勢[6-8]，這給臨床抗革蘭氏陰性菌感染治療帶來巨大的挑戰。因此，通過系統研究16S rRNA甲基轉移酶耐藥機制，建立有效的藥物篩選模型，尋找有效的藥物來抑制16S rRNA甲基轉移酶的活性或進一步恢復耐藥菌對氨基糖苷類抗菌藥物的敏感性或降低細菌對氨基糖苷類的耐藥性具有重要的理論及臨床意義。基于此，本研究進行了16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的構建及其穩定性研究，以期為抗耐藥菌藥物篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

16S rRNA甲基化酶陽性菌Escherichiacoli(編號P-25)，自臨床腹瀉豬分離，經PCR檢測鑒定攜帶16S rRNA甲基化酶RmtB。工程菌E.coliJM109，購自TaKaRa生物試劑公司。質控菌E.coliATCC 25922，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 培養基

水解酪蛋白肉湯(MH Broth)、LB肉湯及LB瓊脂等，均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 主要試劑

EmeraldAmp Max PCR Master Mix、限制性內切酶EcoR Ⅰ(8～20 U/μL)及SalⅠ(8～20 U/μL)，DNA分子量標準DL 2 000 (50 ng/μL)、250 bp DNA ladder、克隆載體pMD18-T Vector、TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0，TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0，TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 供試藥物

共10種藥物，阿米卡星(效價630 μg/mg)、硫酸慶大霉素(效價592 μg/mg)、新霉素(效價652 U/mg)、大觀霉素(效價650 U/mg)，均購自某質檢標準物質中心。氯霉素(99.3%)、氨芐西林(95%)、頭孢唑林(99.3%)，均購自杭州某微生物試劑有限公司。氟苯尼考(98.63%)，購自浙江某藥業有限公司。恩諾沙星(98.7%)，購自上虞某藥業有限公司。多西環素(84.56%)，購自河北某制藥有限公司。

1.5 方法

1.5.1 16S rRNA甲基化酶RmtB全基因的PCR擴增 應用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0提取DNA。設計RmtB全序列引物RmtB-F：5′-CTGT-CAGACCAAGTTTACTC-3′；RmtB-R：5′-GGCGCTGT-AAGTATAATGGC-3′，均由上海英俊生物技術有限公司合成。確定PCR反應體系[9]，利用梯度PCR確定最佳循環條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，30 個循環；72 ℃再延伸5 min。取適量PCR擴增產物，以DL 2 000的DNA分子量標準做參考，以6 V/cm的電壓，用1.5%～2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，結束后拍照分析電泳結果。

1.5.2 RmtB的克隆、轉化及鑒定 按照TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 DNA片段純化回收試劑盒使用說明操作，回收帶全長基因的PCR產物。將回收的目的DNA片斷與pMD18-T載體連接，在16 ℃條件下反應1 h，同時按分子克隆試驗指南操作[10]制備感受態細胞并確定RmtB重組質粒轉化體系，然后進行連接轉化，挑取白色菌落，使用菌落或菌液PCR法確認載體中插入片段的長度大小。用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0提取重組質粒，進行電泳和含量測定。依照RmtB重組質粒雙酶切鑒定體系(表1)，用限制性內切酶EcoR Ⅰ和SalⅠ雙酶切重組質粒DNA，37 ℃恒溫水浴4 h后，取5～10 μL酶切產物，1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察重組菌提取結果。同時將菌落PCR及雙酶切鑒定陽性菌落送至華大基因進行序列測定，測序結果采用DNA Star 6.0與GenBank上下載的序列進行MegAlign。

1.5.3 RmtB重組菌的藥物敏感性檢測 選取受試藥物，按照CLSI的指導原則選取溶劑進行配制和稀釋，在MH瓊脂平板上挑取單個菌落接種于2 mL Muller-Hinton(MH)肉湯管中，37 ℃振蕩培養4～8 h，用調節過Ca、Mg離子的MH肉湯稀釋菌液，使稀釋菌液達到0.5麥氏比濁管濁度，再按 1 ∶100 稀釋菌液至含菌量約為1×106CFU/mL。然后進行MICs測定，記錄藥敏試驗結果，以MIC值位于美國臨床實驗室標準化協會(the Clinical and Laboratory Standards Institute，簡稱CLSI)規定的敏感(susceptible，S)、中介(intermediate，I)、耐藥(resistance，R)折點值范圍判斷藥敏試驗結果。CLSI規定的10種藥物敏感、中介、耐藥折點值判斷標準見表2。

表1 RmtB重組質粒雙酶切鑒定體系

表2 藥敏試驗判斷標準

1.5.4 RmtB重組菌的穩定性研究 取RmtB重組大腸桿菌接種于不含阿米卡星、慶大霉素及氨芐西林的LB固體培養基上，37 ℃過夜培養。2 d再挑取平板上的菌落接種于LB固體培養基，重復以上操作，連續傳3代。將上述連續傳了3代的重組菌接種于LB液體培養基，于37 ℃、200 r/min振蕩培養至菌液D600 nm值約為0.6。再按照1 ∶100比例接種于LB肉湯的試管中，37 ℃、200 r/min振蕩培養，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、26、28、30、32 h后測定菌液的D600 nm。以時間為橫坐標，菌液D600 nm值為縱坐標，繪出重組菌的生長曲線，測定重組質粒傳代以后的最低抑菌濃度(MICs)。

2 結果

2.1 16S rRNA甲基化酶RmtB編碼基因的PCR擴增結果

以16S rRNA甲基化酶陽性菌E.coli(編號P-25)提取的DNA為模板，用含RmtB全基因的引物進行PCR擴增，得到目的片段RmtBP-25(圖1)。

2.2 16S rRNA甲基化酶RmtB編碼基因的克隆轉化及結果

回收16S rRNA甲基化酶RmtB全基因PCR擴增產物，將回收片段與pMD18-T載體連接，并按照分子克隆實驗指南轉化入大腸桿菌JM109，挑取4個白色菌落，分別命名為pRmtB1、pRmtB2、pRmtB3、pRmtB4。提取4個重組質粒DNA進行電泳，結果見圖2。

2.3 RmtB重組菌的菌落PCR鑒定結果

由圖3可知，4個重組質粒中，只有3個pRmtB1、pRmtB2及pRmtB4中含有rmtB全基因。

2.4 RmtB重組菌的雙酶切鑒定結果

經菌落PCT鑒定陽性的重組質粒雙酶切鑒定及結果見圖4。

2.5 RmtB重組菌的序列分析鑒定結果

上述3個經菌落PCR及雙酶切鑒定呈陽性的重組菌，送上海英俊生物技術有限公司進行序列測定。測序結果用DNAStar 6.0與GenBank上下載的序列進行MegAlign。結果證實，16S rRNA甲基化酶RmtB成功轉入大腸桿菌JM109中。

2.6 RmtB重組菌的藥物敏感性檢測結果

RmtB重組菌對10種藥物的MICs，由表2可知，3株重組菌均對阿米卡星、慶大霉素及氨芐西林耐藥。

2.7 16S rRNA甲基化酶RmtB重組菌穩定性研究結果

16S rRNA甲基化酶RmtB重組菌pRmtB1、pRmtB2及pRmtB4在無抗生素篩選壓力下，連續傳3代后的生長曲線及藥敏試驗結果，由圖5及表3可知，重組菌pRmtB1對阿米卡星及慶大霉素仍然高度耐藥，其MIC分別為>1 024 μg/mL及512 μg/mL。而pRmtB2及pRmtB4對阿米卡星及慶大霉素的MIC均為4 μg/mL。

表2 重組菌對10種藥物的MICs μg/mL

3 分析和討論

表3 RmtB重組菌連續傳3代以后對10種藥物的MICs μg/mL

注：“*”表示重組菌pRmtB2和pRmtB4經過傳代3次以后對丁胺卡那霉素和慶大霉素的耐藥性消失。

本研究應用分子克隆技術構建了16S rRNA甲基化酶RmtB重組菌，并對重組菌進行了穩定性研究。結果表明，16S rRNA甲基化酶RmtB重組菌pRmtB1比較穩定，連傳3代以后對丁胺卡那霉素及慶大霉素仍然高度耐藥，其MIC分別為>1 024 μg/mL、512 μg/mL。而pRmtB2、pRmtB4傳代的過程中，對丁胺卡那霉素及慶大霉素的敏感性恢復，其MIC均為 4 μg/mL。研究結果表明，16S rRNA甲基化酶RmtB重組菌pRmtB1穩定性較強，可作為16S rRNA甲基化酶耐藥抑制劑篩選模型。

4 結論

本研究應用分子克隆技術構建了16S rRNA甲基化酶RmtB重組菌，穩定性試驗結果表明，16S rRNA甲基化酶RmtB重組菌pRmtB1穩定性較強，可作為16S rRNA甲基化酶耐藥抑制劑篩選模型。