副干酪乳桿菌FM-LP-4菌株的高密度培養條件優化

王 英， 周劍忠， 施亞萍， 夏秀東， 董 月， 黃自蘇

(1.江蘇省農業科學研究院農產品加工研究所，江蘇南京 210014； 2.南京市脆而爽蔬菜食品有限公司，江蘇南京 211225)

細胞高密度培養(high-cell density cultivation，簡稱HCDC)技術是直投式發酵劑產業發展中的一個關鍵技術。營養物質、生長因子、代謝產物、培養時間、培養溫度、溶氧等環境因素都可能影響細胞的高密度培養。目前國內外對菌體的高密度培養有大量的研究，主要集中在培養基篩選、配方優化和培養條件優化等方面[1-7]。

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)是一種兼性厭氧、不運動、無芽孢的桿菌或長桿菌。研究表明，副干酪乳桿菌作為益生菌在增強人體免疫功能、調節人體腸道菌群平衡、預防疾病等方面有著廣闊的發展前景[8-10]。副干酪乳桿菌FM-LP-4來源于新疆駱駝酸奶，它具有較高的體內、體外抗氧化活性[11]，且具有較強的適應環境能力和較好的加工屬性，這些特性使其具有良好的應用前景。若要實現副干酪乳桿菌的工業化應用，須將該菌株制備成直投式發酵劑，而直投式發酵劑制備的關鍵是保證并提高菌種的活力和活菌數。根據副干酪乳桿菌FM-LP-4的生長需求，本研究從增殖培養基篩選和發酵條件2個方面進行研究，確定優化培養基配方和適宜的培養條件，為副干酪乳桿菌FM-LP-4直投式發酵劑的制備和產品開發提供試驗依據，為其工業化應用提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株資源

副干酪乳桿菌FM-LP-4保存于江蘇省農業科學院農產品加工研究所。

1.2 培養基

MRS(de Man,Rogosa and Sharpe)液體培養基：2.000%葡萄糖、1.000%蛋白胨、1.000%牛肉膏、0.500% 酵母粉、0.500%乙酸鈉、0.200%磷酸氫二鉀、0.200%檸檬酸氫二銨、0.058%硫酸鎂、0.020%硫酸鎂、0.100%吐溫-80。

UMRS(Unnormal de Man,Rogosa and Sharpe)液體培養基：MRS液體培養基中不添加碳源和氮源，配方為0.500%乙酸鈉、0.200%磷酸氫二鉀、0.200%檸檬酸氫二銨、0.058%硫酸鎂、0.020%硫酸鎂、0.100% 吐溫-80，以上培養基在溫度為121 ℃條件下、滅菌20 min。

1.3 主要設備及其來源

1.3.1 主要試劑與設備 主要試劑有1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，簡稱DPPH)，購自南京天為生物科技有限公司；吡咯烷二硫代氨基甲酸銨、鄰菲羅啉，購自中國醫藥集團上海化學試劑公司；對氨基苯磺酸、鹽酸奈乙二胺、亞硝酸鈉及其他所用化學試劑均為分析純級化學試劑，購自南京卓越生物工程有限公司。

主要設備有UV-1600PC紫外分光光度計，購自上海美普達儀器有限公司；YQX-11厭氧培養箱，購自上海躍進醫療器械有限公司；SW-CJ-1C型雙人單面凈化工作臺，購自蘇州凈化設備有限公司；SIGMA3K-15臺式冷凍離心機，購自北京五洲東方科技發展有限公司；124S-CW分析天平，購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；TOMY SX500自動滅菌鍋，購自日本Tomy Digital Biology公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 培養條件優化 溫度對FM-LP-4菌株生長的影響。挑取FM-LP-4菌株單菌落接種于MRS液體試管中，在溫度為 37 ℃ 條件下培養20 h，然后2%接種量轉接于新鮮的MRS液體培養基中，分別于溫度為15、20、25、30、35、40 ℃下培養20 h，測定菌液的D600 nm，每組3個平行試驗。

pH值對FM-LP-4菌株生長的影響。以1 mol/LHCL和NaOH調解MRS液體培養基pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，按2%接種量接種FM-LP-4菌株的新鮮菌液，于溫度為37 ℃下培養20 h，測定菌液的D600 nm，每組3個平行試驗。

裝液量對FM-LP-4生長的影響。50 mL三角瓶中培養基裝液量分別為10、20、30、40、50 mL，按2%接種量接種FM-LP-4菌株的新鮮菌液，于溫度為37 ℃條件下培養 20 h，測定菌液的D600 nm，每組3個平行試驗。

接種量對FM-LP-4菌株生長的影響。接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，接種于MRS液體培養基中，于37 ℃條件下培養20 h，測定菌液的D600 nm，每組3個平行試驗。

培養條件正交優化。考慮到幾種增殖因素之間可能存在聯合協同作用，選定在單因素試驗中以培養溫度、接種量、初始pH值為重要的培養環境因素，利用L9(34)正交試驗優化FM-LP-4菌株的培養條件。

表1 單因素試驗的因素水平

1.4.2 培養基配方優化 碳源對FM-LP-4菌株生長的影響。在UMRS液體培養基上，分別以葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、甘露糖為碳源，添加量為2%；氮源按照MRS培養基中的配方添加。按照2%接種量接種于液體培養基中，在34 ℃條件下培養20 h，每組3個平行試驗，測定發酵液體的D600 nm。

碳源含量對FM-LP-4菌株生長的影響。在研究碳源影響的基礎上，對所選碳源的濃度進行單因素試驗，按照濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%配制MRS培養基，其他成分不變。按照2%接種量接種于液體培養基中，在34 ℃條件下靜止培養20 h，每組3個平行試驗，測定發酵液體的D600 nm。

氮源對FM-LP-4菌株生長的影響。在UMRS液體培養基上，選擇蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、酪蛋白胨、魚蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉作為氮源，添加量為2%，碳源按照MRS培養基中的配方添加。按2%接種量接于UMRS液體培養基中，在34 ℃條件下靜止培養20 h，每組3個平行試驗，測定發酵液體的D600 nm。

氮源含量對FM-LP-4菌株生長的影響。在研究氮源影響的基礎上，對所選氮源的濃度進行單因素試驗，按照濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%配制MRS培養基，其他成分不變。按照2%接種量接種于液體培養基中，在34 ℃條件下靜止培養20 h，每組3個平行試驗，測定發酵液體的D600 nm。

不同營養因子對FM-LP-4菌株生長的影響。選擇包菜汁、番茄汁、胡蘿卜汁、青辣椒汁、白菜汁、黃瓜汁作為營養因子，以不添加任何生長因子的MRS為空白對照，質量分數均為5%。按照2%接種量接種于液體培養基中，在34 ℃條件下靜止培養20 h，每組3個平行試驗，測定發酵液體的D600 nm。以MRS液體培養基作為對照組。

培養基正交優化。考慮到幾種增殖因素之間可能存在聯合協同的交互作用，選定在單因素試驗中增殖效果較明顯的幾種增殖因素(葡萄糖、胰蛋白胨、番茄汁)進行L9(34)正交試驗，其他成分按照MRS培養基中的含量進行配比。優化FM-LP-4菌株的增殖培養基。

表2 因素水平

1.5 驗證試驗

按照正交試驗結果配制優化的培養基，進行接種FM-LP-4菌株培養，測定D600 nm，重復3次。

1.6 數據統計分析

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析；數據間差異比較采用t檢驗，差異顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 溫度對FM-LP-4菌株生長的影響

由圖1可以看出，隨著溫度的升高，FM-LP-4菌株的菌體密度呈先升高后降低的趨勢，在溫度為34 ℃時，菌體密度最高，因此，FM-LP-4菌株的適宜生長溫度在34 ℃左右。

2.2 初始pH值對FM-LP-4菌株生長的影響

培養基的初始pH值對菌體的生長也有重要的影響，合適的pH值能縮短菌體的延滯期，較快地進入菌株對數生長期。由圖2可知，MRS的初始pH值為6.5時，在相同的生長時間，菌體密度最高。因此，最適的初始pH值為6.5。

2.3 接種量對FM-LP-4菌株生長的影響

接種量較低會延長菌體的延滯期，接種量較高菌體會較快進入對數生長期，進而較快進入菌體穩定期，在穩定期菌體容易發生自溶現象，進而降低菌體密度。因此，合適的接種量也是菌體高密度培養的一個重要條件。由圖3可以看出，隨著接種量的增加，菌體密度呈現先增加后緩慢降低的趨勢，接種量為4%時菌體密度達到最大值，但接種量為3%～5%時，菌體密度沒有顯著(P>0.05)區別，因此選擇4%為最適接種量。

2.4 裝液量對FM-LP-4菌株生長的影響

一般乳酸菌均是兼性厭氧型，環境的氧含量對菌株的生長有明顯的影響。本研究利用50 mL三角瓶，裝不同含量的MRS液體培養基，在相同條件下培養相同時間，檢測FM-LP-4菌株的菌體密度。由圖4可以看出，隨著裝液量的增加，FM-LP-4菌株密度升高，在裝液量為40 mL條件下，菌體密度達到最高，但與裝液量為50 mL的三角瓶中的菌體密度沒有顯著差異(P>0.05)，為操作方便，選擇80%為最適裝液量。

2.5 FM-LP-4菌株培養條件正交優化

考慮到因素之間可能存在聯合協同的交互作用，選定在單因素試驗中培養溫度、接種量、初始pH值為3個主要因素，利用L9(34)正交試驗優化FM-LP-4菌株的培養條件。由表3可以看出，3個因素對FM-LP-4菌株活菌增殖量的影響順序為A>C>B，即影響FM-LP-4菌株生長發育的最主要環境因素是培養溫度，其次是初始pH值。確定最佳增殖培養條件為A2B1C3，即培養溫度為34 ℃、接種量為3%、初始pH值為6.8。

2.6 不同碳源對FM-LP-4菌株生長的影響

培養基中碳源和氮源成分及其適宜添加量的選擇一直是改善乳酸菌生長的手段[12-13]，經常使用增菌培養基包括配制培養基(如MRS、M17等)、乳基質培養基、乳清基質培養基等，其中，乳基質培養基、乳清基質培養基比較適合乳酸菌的生長，生長達到穩定期的乳酸菌的菌體密度較高，但因其增殖慢或不易分離菌體而不宜采用。乳酸菌增殖培養基應具有以下2個特點：(1)適合菌體生長、繁殖速度快，在較短時間內可以得到大量高活力細胞；(2)菌體與培養基易分離、成本低廉[14-15]。因此，研究選擇以MRS為基本培養基，在此基礎上改變碳源、氮源，進而篩選合適的碳源和氮源。另外有研究報道，在MRS培養基中添加蔬菜汁能夠改善乳酸菌的生長，增加菌體密度，因此，本研究選擇一些常見蔬菜汁進行試驗，目的是能夠增加FM-LP-4菌株的菌體密度，為FM-LP-4菌株直投發酵劑的開發提供理論依據和技術支持。

表3 FM-LP-4菌株培養基條件優化正交試驗結果

本研究選擇乳酸桿菌屬生長比較容易利用的葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、甘露糖為碳源，這些碳源在市場上容易買到。由圖5可知，不同碳源對FM-LP-4菌株生長的影響差別很大，其中以葡萄糖為碳源的培養基中 FM-LP-4 菌株的菌體密度最高，生長20 h時，D600 nm值達到2.14，其次是果糖，D600 nm值為2.09，以甘露糖為碳源的培養基中 FM-LP-4 菌株菌體密度最低，D600 nm僅為1.70，比以葡萄糖為碳源的培養基菌體D600 nm值低0.44，因此，選擇葡萄糖為 FM-LP-4 菌株適宜生長碳源。

2.7 葡萄糖不同含量對FM-LP-4菌株生長的影響

添加合適量的碳源對菌體生長有很大的影響，較低的碳源含量不足以支持菌體的生長，高含量的碳源會增加培養液的滲透壓，不利于菌體的生長。由圖6可知，隨著碳源含量的增加，菌體密度開始呈現增長趨勢，當葡萄糖含量為3%時，菌體密度達到最高，但與4%葡萄糖含量的菌體密度差異不顯著(P>0.05)，隨著碳源含量的繼續增加，菌體密度又呈下降趨勢，因此，葡萄糖最適的添加量為3%。

2.8 不同氮源對FM-LP-4菌株生長的影響

選擇蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、魚蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉等氮源作為篩選適合FM-LP-4生長的氮源。由圖7可知，有機氮源更適合FM-LP-4菌株的生長，在有機氮源中，以胰蛋白胨的促生長效果最明顯，牛肉膏次之。因為牛肉膏中含有肌酸、肌酸酐、氨基酸類、核苷酸類、有機酸類、礦物質類及維生素類的水溶性物質，能夠為乳酸菌生長提供多種營養物質，因此，對于氮源來說，選擇胰蛋白胨和牛肉膏為復合氮源，其中，添加牛肉膏的含量按照MRS基本培養基的添加量進行，因為其除了作為氮源來源，還提供其他的營養成分。

2.9 胰蛋白胨不同含量對FM-LP-4菌株菌體密度的影響

添加合適量的氮源對菌體生長有很大的影響，較低的氮源含量不足以支持菌體的生長，高含量的氮源會增加培養液的滲透壓，不利于菌體的生長。由圖8可知，隨著胰蛋白胨含量的增加，菌體密度先呈上升趨勢，當胰蛋白胨含量為3%時，菌體密度達到最高，隨著胰蛋白胨含量的進一步增加，菌體密度呈下降趨勢，因此，胰蛋白胨最適的添加量為3%。

2.10 不同蔬菜汁對FM-LP-4菌株生長的影響

在乳酸菌高密度培養基的篩選和優化研究中，除了對氮源和碳源進行優化研究外，蔬菜汁對乳酸菌增殖的影響也有大量研究，葛宗昌等研究發現，馬鈴薯汁能促進干酪乳桿菌的生長[16]。本研究選擇包菜汁、番茄汁、胡蘿卜汁、青辣椒汁、白菜汁、黃瓜汁作為營養因子，檢測不同的蔬菜汁對FM-LP-4菌株生長的影響。由圖9可知，在MRS基礎培養基中，添加不同的蔬菜汁，菌體密度呈不同的變化，其中，番茄汁對FM-LP-4菌株的增殖效果最好，MRS基本培養基中FM-LP-4菌株的D600 nm為1.992，含有番茄汁的FM-LP-4菌株的D600 nm高達2.213；其次是胡蘿卜汁，D600 nm高達2.194，可見不同的菌株對蔬菜汁的響應是不同的，因此，選擇番茄汁為最適的營養增殖因子。

2.11 番茄汁不同添加量對FM-LP-4菌株生長的影響

由圖10可知，隨著番茄汁添加量的增加，菌體密度開始逐漸增加，但增加到一定程度，增加效果不再明顯，考慮到經濟成本，選擇合適的添加量為6%。

2.12 FM-LP-4菌株增殖培養基正交優化

幾種增殖因素之間可能存在聯合協同作用，選定在單因素試驗中增殖效果較明顯的幾種增殖因素(葡萄糖、胰蛋白胨和番茄汁)進行L9(34)正交試驗，其他營養成分按照MRS配方進行配制，以優化FM-LP-4菌株的最佳增殖培養基。由表4可知，3個因素對FM-LP-4菌株活菌增殖量的影響順序為B>C>A，即影響FM-LP-4菌株生長發育的最主要因素是胰蛋白胨，其次是番茄汁。確定最佳增殖培養基配方為A2B3C2，即30 g/L的葡萄糖、35 g/L的胰蛋白胨、60 g/L番茄汁。

表4 FM-LP-4菌株培養基成分優化正交試驗結果

2.13 驗證試驗

按照確定的培養基配方配制培養基，以原始MRS培養基為對照，裝液量均為80%，以3%的接種量接種，在溫度為 34 ℃ 條件下培養24 h，重復3次。原始培養基的FM-LP-4的D600 nm平均值為2.15，優化培養中FM-LP-4的D600 nm平均值為2.54，優化后的菌體D600 nm提高18.14%。

3 結論

通過對FM-LP-4菌株的培養條件和培養基進行研究，為FM-LP-4菌株作為功能型高密度發酵劑的制備提供技術支持。結果表明，FM-LP-4菌株培養條件的優化結果確定FM-LP-4菌株的最佳增殖培養條件是培養溫度為 34 ℃、接種量為3%、初始pH值為6.8。FM-LP-4菌株培養基配方的優化確定為30 g/L葡萄糖、35 g/L胰蛋白胨、60 g/L 番茄汁，其他成分與MRS培養基基本配方一致。在優化后的培養條件下培養18 h，FM-LP-4菌體D600 nm提高18.14%。