肝細胞生長因子對口腔鱗癌裸鼠移植瘤的作用及其機制研究

杜洪亮 何等旗 于濤 車銀富 陶峰 李陽

肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種生理狀態下由間質細胞產生的具有多功能的細胞生長因子，其與受體c-Met結合后，發揮多種生物學作用，包括促進多種腫瘤細胞的增殖、分化、轉移、刺激新生血管及淋巴管生成等[1-3]。有研究發現，HGF促進腫瘤轉移是通過其受體c-Met起作用的[4]。另有研究表明，HGF在腫瘤中的表達與VEGF-C的表達相關[5]。但HGF調控腫瘤細胞增殖、分化的具體機制尚不清楚。

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，以局部侵襲和淋巴轉移為特點[6]。口腔鱗癌患者存在HGF及受體c-Met的高表達[7]，但HGF對口腔鱗癌患者的效應及其機制尚不清楚。有研究發現，口腔鱗癌患者HGF的增高與VEGF-C的表達有關[8]。本研究通過口腔鱗癌裸鼠移植瘤模型，觀察不同劑量HGF對口腔鱗癌裸鼠腫瘤生長的效應，并探討其作用機制，為口腔鱗癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 BALB/c-nu/nu裸鼠36 只，5 周齡，雌雄兼用，體重18～30 g(上海實驗動物中心提供)。瘤株：人舌鱗癌細胞株Tca8113由四川大學華西口腔疾病研究國家重點實驗室提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 HGF(Peprotech，美國)；兔抗多克隆抗體HGF、c-Met(Santa Cruz Biotechnology，美國)；VEGF-C(Zymed,美國)；DMEM高糖培養基、MEM培養基、胎牛血清(Hyclone，美國)；高速冷凍離心機(Sigma，Sigma 3-18K，德國)；CO2恒溫細胞培育箱(Heraeus，德國)；超凈工作臺(Nuaire,美國)；OLYMPUS IX71倒置相差顯微鏡(Olympus,美國)，微量移液槍(Eppendorf公司，德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立 32 只裸鼠皮下接種Tca8113細胞懸液0.1 ml，濃度為5×106/0.1 ml。接種后2 周，腫瘤直徑達0.2～0.5 cm，將荷瘤裸鼠隨機分為5 組，陰性對照組8 只，其余各組6 只。

1.2.2 實驗分組 將口腔鱗癌裸鼠移植瘤模型裸鼠32 只，隨機分為5 組：①陰性對照組：8 只，不做任何處理；②B組：6 只，瘤內注射PBS 50 μl；③HGF 20 ng組：5 只，瘤內注射HGF 20 ng/d；④HGF 40 ng組：5 只，瘤內注射HGF40 ng/d；⑤HGF 100 ng組：5 只，瘤內注射HGF 100 ng/d。注射1 次/d，連續給藥5 d后，第6天測腫瘤體積，取瘤塊，稱瘤重。

1.2.3 移植瘤生長情況評價 腫瘤體積：測量腫瘤最長徑(a)及與之垂直的最短徑(b)，按公式V=0.5×a×b2計算腫瘤體積[9]。觀察腫瘤體積變化。

腫瘤重量：連續給藥5 d后，第6天脫臼處死小鼠，小心剝離瘤體，稱重。

1.2.4 荷瘤小鼠移植瘤HGF、c-Met及VEGF-C的表達測定 采用免疫組織化學法，用兔抗人多克隆抗體HGF(1∶100稀釋)免疫染色檢測HGF的表達，兔抗人多克隆抗體c-Met(1∶100稀釋)免疫染色檢測c-Met的表達，兔抗人多克隆抗體VEGF-C(1∶100稀釋)免疫染色檢測VEGF-C的表達， 染色依照試劑盒說明書進行。

1.3 結果判讀

HGF的表達定位于細胞膜及細胞質呈棕黃色顆粒為陽性。c-Met的表達主要位于細胞膜和細胞質，VEGF-C的表達以細胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性表達，胞漿透明或無色為陰性。每張病理切片計數10 個高倍鏡下陽性細胞的數目。免疫組化染色的評估由2 名病理科醫師采用盲法分別獨立進行。首先進行定性分析抗體染色表達模式的差別，然后進行定量分析。兩名病理醫師判斷的差別通過討論解決。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 口腔鱗癌裸鼠移植瘤模型建立情況

36 只裸鼠有32 只成瘤，成瘤率為88.89%。皮下接種Tca8113細胞懸液2 周后，裸鼠皮下明顯可見瘤體生長，約0.2～0.5 cm大小。實驗全程無裸鼠死亡。

2.2 腫瘤體積、瘤重及破潰情況

荷瘤裸鼠荷瘤情況及腫瘤破潰見圖 1。分組后各組荷瘤裸鼠體重差異無統計學意義(P>0.05)。腫瘤體積在注射HGF前和注射HGF后以及腫瘤質量各組之間的差異均無統計學意義(P>0.05)。腫瘤破潰情況各組之間差異無統計學意義(P>0.05)(表 1)。

圖 1 荷瘤裸鼠荷瘤情況及腫瘤破潰情況

表 1 裸鼠腫瘤體積、瘤重及腫瘤破潰情況

2.3 腫瘤HGF、c-Met及VEGF-C的表達

腫瘤HGF、c-Met及VEGF-C的表達結果見表 2。

荷瘤裸鼠腫瘤HGF的表達在HGF 40 ng組和HGF 100 ng組明顯增高。HGF 40 ng組與陰性對照組相比，差異具有統計學意義(P=0.046),與PBS組相比差異具有統計學意義(P=0.049)；HGF 100 ng組與陰性對照組及PBS組相比，差異均具有統計學意義(P<0.05)；但HGF 40 ng組與HGF 100 ng組之間的差別不明顯(P=0.723)。病理切片同樣顯示，HGF蛋白的表達在HGF 40 ng組和HGF 100 ng組最多，其次為HGF 20 ng組，表達最少的為陰性對照組和PBS組。各組HGF的表達病理染色切片見圖 2。

表 2 腫瘤HGF、c-Met及VEGF-C的陽性細胞數Tab 2 Positive cell count of the expression of HGF、c-Met and VEGF-C in the tumor of the groups

注： ①HGF 40 ng組與陰性對照組比較,P=0.046; ②HGF 40 ng組與PBS組比較,P=0.049; ③HGF 100 ng組與陰性對照組比較,P=0.020; ④HGF 100 ng組與PBS組比較,P=0.021; ⑤HGF 40 ng組與陰性對照組比較,P=0.023; ⑥HGF 40 ng組與PBS組比較,P=0.023; ⑦HGF 100 ng組與陰性對照組比較,P=0.002; ⑧HGF 100 ng組與PBS組比較,P=0.002; ⑨HGF 40 ng組與陰性對照組比較,P=0.01; ⑩HGF 40 ng組與PBS組比較,P=0.011

荷瘤裸鼠腫瘤c-Met的表達在HGF 40 ng組和HGF 100 ng組明顯增高。HGF 40 ng組與陰性對照組及PBS組相比，差異均具有統計學意義(P=0.023)；HGF 100 ng組與陰性對照組及PBS組相比，差異均均具有統計學意義(P=0.002)。病理切片同樣顯示，c-Met的表達在HGF 40 ng組和HGF 100 ng組最多，其次為HGF 20 ng組，表達最少的為陰性對照組和PBS組。各組c-Met的表達病理染色切片見圖 2。

荷瘤裸鼠腫瘤VEGF-C的表達在HGF 40 ng組最多。HGF 40 ng組與陰性對照組及PBS組相比，差異均具有統計學意義(P=0.010，P=0.011)；其余各組比較，差異均無統計學差異(P>0.05)。病理切片示，c-Met的表達在HGF 40 ng組最多，其次為HGF 100 ng組，再次20 ng組，表達最少的為陰性對照組和PBS組。各組VEGF-C的表達病理染色切片見圖 2。

3 討 論

HGF為間質細胞分泌的一種生長因子，屬于纖維蛋白溶解酶原-凝血酶原基因超家族，其與上皮細胞上的特異性受體結合后發揮其生物活性。研究發現，HGF及其受體在口腔鱗癌患者中存在異常表達[10-11]。c-Met為HGF蛋白受體，為酪氨酸激酶家族成員[12]。當HGF與c-Met結合導致后者發生磷酸化后，其下游多個信號通路接著被激活，包括Src/FAK，P13K/Akt，Ras/MAPK等[13]。這些信號通路與VEGF-C及淋巴管生成相關主要有P13K/Akt和MEPK 2 種信號通路[14]。而VEGF-C是目前公認的淋巴管生成因子，其表達與淋巴管的生成密切相關[15-16]。本課題組的前期研究也表明在OSCC中，癌旁的淋巴管密度與c-Met和VEGF-C的表達密切相關[17]。

圖 2 裸鼠腫瘤HGF、c-Met、VEGF-C蛋白的表達 (IHC, ×400)

該研究結果提示不同濃度的HGF對荷瘤裸鼠腫瘤生長的影響不同，在HGF 40 ng組腫瘤中HGF、c-Met及VEGF-C的表達最高，這與之前的研究結果一致[18]，即在Tca8113細胞培養中，HGF=40 ng/ml時VEGF-C濃度達到峰值，其促進腫瘤生長的作用最明顯。HGF 20 ng組與HGF 100 ng組中，VEGF-C的表達下降。該研究中HGF干預前后腫瘤的體積、瘤重及破潰情況差異不明顯，這可能與HGF干預時間短有關，HGF干預時間為5 d，53.13%的腫瘤出現破潰，故未再進一步進行HGF干預。

腫瘤生長速度大于血管生長速度，導致腫瘤出現破潰。該研究中，陰性對照組與PBS組腫瘤破潰率為62.50%和83.33%，腫瘤破潰比率高，在HGF干預組，腫瘤破潰比率分別為HGF 20 ng組50%，HGF 40 ng組50%，HGF 100 ng組16.67%，可能為HGF促進腫瘤血管生成有關，有研究顯示，HGF能夠促進腫瘤血管的再生[19]，這與該研究的結果一致。

該研究也存在一定的不足。樣本量不夠大。另外，因腫瘤破潰，HGF干預時間不夠長，未進行進一步的HGF/c-Met下游多個信號通路抑制試驗研究，這些通路包括包括Src/FAK，the p120/STAT3，P13K/Akt，Ras/MAPK等。本研究未使用基因沉默等技術切斷HGF/c-Met與VEGF-C之間的分子聯系，未抑制HGF/c-Met-VEGF-C引導的OSCC淋巴轉移。之后的研究將使用基因沉默技術，進一步研究HGF/c-Met對VEGF-C的影響及對腫瘤的轉移、分化、淋巴管生成進行研究。進一步明確HGF對口腔鱗癌的作用及其分子機制。