辛伐他汀促進(jìn)伴骨吸收慢性根尖周炎骨質(zhì)修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究

鄭立娟 湯晨 趙旭

慢性根尖周炎是口腔臨床常見疾病，根管治療為較重要的方法，但對(duì)于有些慢性根尖周炎所引起的大面積根尖骨質(zhì)的吸收，除根尖外科手術(shù)外尚缺乏有效的方法，而且骨質(zhì)吸收后自行愈合的時(shí)間較長(zhǎng)，為進(jìn)一步的修復(fù)工作帶來很多問題[1]。根尖骨吸收的機(jī)制尚不清楚，其修復(fù)方法，有自體骨移植、異體骨移植、骨移植替代材料等。近年來，藥物抑制根尖炎骨吸收為根尖炎的骨質(zhì)修復(fù)開辟了一條新途徑。

1999 年Mundy[2]首先提出他汀類藥物具有促進(jìn)骨質(zhì)生成的作用。辛伐他汀是HMG-CoA的抑制劑,能降低血液中的膽固醇水平，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化具有防治作用[3]。后被證明能夠誘導(dǎo)骨密度的增加，可刺激成骨細(xì)胞的分化和成熟，以及骨形成相關(guān)基質(zhì)的生成的作用，從而有明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成和抑制骨吸收的雙重作用。

關(guān)于辛伐他汀促進(jìn)成骨的實(shí)驗(yàn)研究，大多集中在對(duì)于體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的影響[4]，近年來將辛伐他汀用于體內(nèi)骨組織，主要有辛伐他汀對(duì)于骨質(zhì)疏松大鼠模型的成骨作用的影響，可能有保護(hù)骨質(zhì)疏松的作用，但在口腔醫(yī)學(xué)中的相關(guān)研究，主要在種植體，正畸領(lǐng)域以及牙周組織改建方面，用于根尖骨國(guó)內(nèi)未見文獻(xiàn)報(bào)道，國(guó)外只有少數(shù)研究他汀類藥物的抗骨吸收活動(dòng)[5],本課題通過實(shí)驗(yàn)研究論證辛伐他汀用于抑制根尖炎骨質(zhì)吸收和促進(jìn)成骨的作用，為他汀類藥物用于治療伴骨吸收慢性根尖周炎骨修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8 周齡SPF級(jí)SD大鼠32 只，雄性，體重(200±20) g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要材料及儀器 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素(湛江安度斯生物有限公司)；辛伐他汀原料藥(紐拜爾醫(yī)藥科技有限公司)；兔抗鼠BMP2多克隆抗體、DAB顯色試劑盒(博奧森生物技術(shù)有限公司)；低溫高速離心機(jī)(nohbimpex technologies Co.ltd,iFuge,HCT,德國(guó))、全自動(dòng)生化分析儀(迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司，CS-6400);恒溫水浴箱(上海基瑋試驗(yàn)儀器有限公司，DK-S28)、掃描電子顯微鏡(Olympus公司，F(xiàn)V3000,日本)；直接數(shù)字化X線成像系統(tǒng)RVG(SOREDX，DIGORA，Optime,芬蘭)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立大鼠慢性根尖周炎骨吸收動(dòng)物模型 將32 只大鼠隨機(jī)分成4組，分為A組(正常對(duì)照組)8 只、B組(模型觀察組)8 只，C組16 只，取B組和C組共24 只大鼠，首先將大鼠稱重，用10%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，仰臥固定上下頜，第一磨牙開髓，置內(nèi)毒棉球并壓緊，動(dòng)物清醒后，正常飼養(yǎng)。取B組大鼠，于開髓后的第2周末和第3周末分別處死4 只，分離上下頜骨，取牙頜骨聯(lián)合標(biāo)本，置于4%的甲醛溶液中固定待用。

1.2.2 建立大鼠辛伐他汀用藥模型 于建模手術(shù)3 周末根尖炎模型建立成功時(shí)，取C2組(辛伐他汀組)大鼠，分別稱重，按照20 mg/kg/d劑量的辛伐他汀配成1 ml的溶液灌胃，于第3周末開始，每天1 次，持續(xù)2 周。C1組(生理鹽水組)每天給予等量生理鹽水灌胃，喂藥2 周后取A組，C1和C2組于心尖處穿刺取血，至于紫色采血管中靜置，離心后取上清液，自動(dòng)生化分析儀測(cè)量血清ALP、Ca、P，處死C1組和C2組，分離上下頜骨組織，取牙頜骨聯(lián)合標(biāo)本，置于4%的甲醛溶液中固定，分別用RVG成像系統(tǒng)拍攝X線片[6]。

1.2.3 制作組織病理學(xué)切片并進(jìn)行HE染色 按步驟進(jìn)行二步法免疫組織化學(xué)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取2 個(gè)視野，記錄陽性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算陽性表達(dá)率并攝像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)性根尖周炎骨吸收X線影像分析

術(shù)后2 周末，大鼠根尖周組織開始出現(xiàn)低密度的陰影；3 周末時(shí)，陰影面積明顯增大，此時(shí)為根尖周炎癥的高峰期。可見，根尖周陰影面積的增寬隨著根尖周炎癥的不斷進(jìn)展而逐漸變大，疾病發(fā)展階段，根尖陰影面積與時(shí)間成正比關(guān)系。而至5 周末時(shí)炎癥吸收趨于穩(wěn)定，轉(zhuǎn)為慢性，用藥灌胃2 周后，生理鹽水組大鼠根尖骨吸收陰影面積未見明顯改變，辛伐他汀組大鼠根尖骨吸收陰影面積減小，有明顯愈合趨勢(shì)(圖 1)。

圖 1 各組大鼠上下頜第一磨牙根尖X線片

2.2 血清骨形成相關(guān)生化指標(biāo)的測(cè)定

由表 1可見，血清鈣在各組間比較：按顯著性為0.05的水平，C1組與A組比較P=0.040，C2組與A組比較P=0.023，C2組與C1組比較P=0.795。

表 1 給藥前后血清Ca、P、ALP濃度的變化

注： ① 與A組比較，P<0.05； ② 與C1組比較，P>0.05； ③ 與A組比較，P>0.05； ④ 與C1組比較，P<0.05

血清磷在各組間比較：C1組與A組比較P=0.026，C2組與A組比較P=0.515，C2組與C1組比較P=0.316。

ALP在各組間比較：C1組與A組比較差異有顯著性(P=0.000)，C2組與A組比較P=0.172，C2組與C1組比較P=0.020。

2.3 實(shí)驗(yàn)性根尖周炎組織病理學(xué)分析

用雙目光學(xué)顯微鏡用×100倍數(shù)觀察組織病理切片，隨機(jī)選取2 個(gè)視野，觀察炎癥狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，術(shù)后2 周末，牙髓組織中可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域并有局部或大部分牙髓壞死，牙周膜間隙可見增寬，根尖周組織開始出現(xiàn)炎癥及根尖周牙槽骨開始出現(xiàn)破壞；3 周末時(shí)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯加重，根尖周炎癥及牙槽骨破壞明顯加重；至第5周末時(shí)， 表現(xiàn)為慢性炎癥，根尖周骨組織破壞不再加重，周圍有纖維組織包繞，局部牙骨質(zhì)可見增生，而C2組根尖牙骨質(zhì)及根尖骨增生明顯，骨修復(fù)現(xiàn)象明顯(圖 2)。

組織病理學(xué)切片按照統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和盲法的原則進(jìn)行評(píng)估。

2.4 BMP2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析

BMP2陽性產(chǎn)物定位于細(xì)胞核，呈棕黃色， C2組(辛伐他汀組)陽性染色出現(xiàn)于骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及部分間充質(zhì)細(xì)胞,陽性著色深且廣泛， C1組(生理鹽水組)陽性染色出現(xiàn)于骨基質(zhì)表面及骨小梁周圍的部分骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞,陽性著色減少；A組(正常對(duì)照組)陽性染色少，分散淡染，用Image pro-plus圖像分析軟件分別計(jì)算陽性率(含棕黃色顆粒細(xì)胞)并取平均值。A、C1和C2組陽性率分別為(25.0±2.7)%、(45.0±3.2)%和(62.0±5.1)%。C1與C2組分別與A組相比(P=0.000)；C2組與C1組比較(P=0.000)，辛伐他汀組大鼠BMP2陽性表達(dá)率明顯升高(圖 3)。

圖 2 大鼠根尖周炎組織學(xué)觀察 (HE, ×100)

圖 3 BMP2在各組大鼠根尖周炎癥組織中的表達(dá) (×400)

3 討 論

慢性根尖周炎主要的病理表現(xiàn)為炎性肉芽組織和牙槽骨破壞。臨床上對(duì)于根尖周炎的治療，根管治療常常獲得較好的療效，但是慢性根尖周炎伴有大面積的骨吸收也較常見，除了根管治療同時(shí)需進(jìn)行根尖外科手術(shù)。這類疾病骨吸收面積大，自行愈合時(shí)間較長(zhǎng)，為修復(fù)工作帶來難題，臨床上對(duì)于慢性根尖周炎導(dǎo)致骨吸收的治療和促進(jìn)骨質(zhì)的愈合在不斷探索中。

建立根尖周病的動(dòng)物模型是研究根尖周病發(fā)病機(jī)制的重要手段，以此來觀察炎癥浸潤(rùn)的范圍和程度、骨吸收的面積以及各種不同因子在根尖周炎中的表達(dá)[7]。也可施加一些干預(yù)因素(如藥物、激素等)，來觀察這些因素對(duì)根尖周病的影響。本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)毒素棉球置于髓腔中并開放于口腔自然環(huán)境中，這種方法既可使內(nèi)毒素發(fā)揮快速有效的致炎作用，又可使口腔中的混合菌感染牙髓，細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)[8]主要成分為L(zhǎng)PS，LPS為炎性刺激物，能夠使機(jī)體產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，進(jìn)一步造成病理性損傷，導(dǎo)致骨質(zhì)吸收等[9]。本實(shí)驗(yàn)兩周末，3 周末大鼠均可見明顯地觀察到根尖骨吸收陰影，根尖區(qū)牙周膜及硬組織隨著根尖炎癥的不斷進(jìn)展而出現(xiàn)骨質(zhì)的吸收破壞，且3 周末陰影面積較兩周末明顯增大，大鼠根尖周炎模型建模成功，隨后炎癥吸收趨于穩(wěn)定，并出現(xiàn)增生修復(fù)現(xiàn)象。此種方法可以在周期較短的過程中觀察根尖炎的發(fā)展和致病機(jī)制，這樣得到的動(dòng)物模型與文獻(xiàn)報(bào)道的其他方法比較，其病變發(fā)病較快，周期短，方便快捷且接近于根尖周炎的自然發(fā)病過程[10-11]。

他汀類藥物為羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，辛伐他汀為他汀類藥物常用的一種，廣泛應(yīng)用于降低血膽固醇及低密度脂蛋白的水平，可起到預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、降低心血管疾病的發(fā)生率的作用。以往研究證實(shí)辛伐他汀可影響骨代謝，具有使骨量增加，使骨密度值提高，促進(jìn)骨形成相關(guān)基因的表達(dá)。本研究通過口服給藥來研究辛伐他汀對(duì)于根尖骨組織骨代謝的影響。

血清總堿性磷酸酶 (ALP)是評(píng)價(jià)骨形成和骨轉(zhuǎn)換的常用指標(biāo)。ALP與骨礦化過程密切相關(guān)，因?yàn)閴A性的環(huán)境有利于骨鈣化的過程，使其更為活躍，成骨細(xì)胞能夠釋放ALP，所以堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞分化的早期指標(biāo)之一，其表達(dá)隨著成骨細(xì)胞的發(fā)展而加強(qiáng)，代表骨形成的狀況，本實(shí)驗(yàn)中，C2組(辛伐他汀組)在給藥2周后，通過大鼠血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶濃度較對(duì)照組明顯升高，表明成骨細(xì)胞處于活躍狀態(tài)，接近正常對(duì)照組，這說明辛伐他汀可明顯刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化，有明顯促進(jìn)骨形成的作用。與沈蘭花等[12]采用MTT法、二辛可寧酸法檢測(cè)辛伐他汀可促進(jìn)堿性磷酸酶的活性的研究結(jié)果相一致。

在以往大鼠實(shí)驗(yàn)研究中，他汀類藥物可以局部誘導(dǎo)成骨，加快骨修復(fù)。通過一系列的分子最終作用于骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP2),使成骨細(xì)胞內(nèi)BMP2基因表達(dá)的增強(qiáng)[13]。

他汀類藥物可以通過多條通路、多個(gè)連鎖環(huán)節(jié)最終促進(jìn)BMP2的表達(dá)和活性。他汀類藥物可以通過以下信號(hào)通路促進(jìn)BMP2表達(dá)：如辛伐他汀可以使Smad1和Smad5信號(hào)蛋白的表達(dá)水平明顯增加；還可作用于小GTP-包含蛋白，使eNOS表達(dá)增加，增強(qiáng)BMP2的活性；也可通過PI3 K/Akt相關(guān)信號(hào)通路，增加內(nèi)皮細(xì)胞eNOS-mRNA的穩(wěn)定性,使eNOS的活性增強(qiáng)，具有使BMP2的表達(dá)上調(diào)的作用[14]；還可以抑制Rho和Rho激酶的活性，從而導(dǎo)致BMP2的表達(dá)上調(diào)。還存在一些交叉，如促分裂素原活化蛋白激酶，MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑和Wnt信號(hào)通路[15-16]，辛伐他汀作用于根尖骨修復(fù)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

而BMP2是對(duì)于骨形成和骨修復(fù)具有極強(qiáng)的促進(jìn)作用的蛋白，它不僅可以促進(jìn)成骨細(xì)胞及其相關(guān)前體細(xì)胞的增殖，并且具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用，同時(shí)具有促進(jìn)相關(guān)間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，還可誘導(dǎo)具有多種分化潛能的成纖維細(xì)胞間質(zhì)前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟的成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有成骨作用能力的細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮成骨細(xì)胞強(qiáng)大的成骨作用，增加骨量，修復(fù)骨質(zhì)的微損傷，防治骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[17]。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道[18]，BMP2可以有效地增加ALP的活性，如前文所述，ALP活性增強(qiáng)，成骨作用增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)在大鼠根尖炎骨吸收動(dòng)物模型建模成功后，給予辛伐他汀溶液20 mg/kg/d灌服2 周后，取牙頜骨聯(lián)合標(biāo)本制作病理切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組根尖牙槽骨成骨細(xì)胞內(nèi)可見明顯的陽性染色，而對(duì)照組僅有少量表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組陽性染色率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本實(shí)驗(yàn)論證了口服辛伐他汀對(duì)于根尖炎骨組織的修復(fù)有一定的促進(jìn)作用。為藥物輔助治療根尖炎骨吸收提供了新的思路。臨床上治療慢性根尖周炎骨吸收目前主要采用根管治療，必要時(shí)配合根尖手術(shù)，但有時(shí)慢性根尖周炎伴有大面積骨吸收不易愈合或愈合時(shí)間較長(zhǎng)，為進(jìn)一步的修復(fù)工作帶來難題，因觀察愈合周期較長(zhǎng)，易有牙折及冠部滲漏的可能，影響根管治療的療效；若在根尖病灶不愈合進(jìn)行早期冠修復(fù)，則存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。所以用藥物輔助治療來促進(jìn)骨吸收的愈合，可解決以上難題。關(guān)于辛伐他汀促進(jìn)根尖炎骨質(zhì)的修復(fù)的分子機(jī)制、作用機(jī)理、劑型以及給藥方式等還有待于進(jìn)一步探索。