新生豬缺氧缺血性腦損傷后基底節(jié)區(qū)Tau蛋白與谷氨酸變化的相關(guān)研究

鄭 陽，王曉明

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院放射科，遼寧 沈陽 110004）

微管是腦內(nèi)的細(xì)胞骨架成分，主要由微管蛋白及微管相關(guān)蛋白組成，微管影響腦組織細(xì)胞多種功能。Tau蛋白是腦內(nèi)含量最多的微管相關(guān)蛋白，神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要在少突膠質(zhì)細(xì)胞中廣泛表達(dá)。腦組織內(nèi)Tau蛋白的作用主要是與微管蛋白結(jié)合，促進(jìn)微管形成，同時(shí)能夠維持微管的穩(wěn)定性[1]。Tau蛋白異常磷酸化可導(dǎo)致其喪失正常的生理功能，異常過度磷酸化后與微管蛋白的結(jié)合能力僅是正常蛋白結(jié)合能力的1/10，失去維持微管穩(wěn)定性的作用，致使受累微管結(jié)構(gòu)破壞，正常軸突轉(zhuǎn)運(yùn)障礙[2]。Wen等證實(shí)[3]缺氧缺血（Hypoxic ischemia，HI）后，神經(jīng)元中 Tau蛋白過度磷酸化與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。由于谷氨酸（Glutamate，Glu）是腦內(nèi)含量較多的興奮性氨基酸，參與腦內(nèi)能量代謝的調(diào)節(jié)，本研究采用新生豬HI模型研究HI后腦組織內(nèi)Tau蛋白及Glu的變化，揭示HI后Tau蛋白及Glu變化的相關(guān)性。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用新生約克夏豬45只，3～5 d日齡，體質(zhì)量1～1．5 kg，性別雄性（為盡量減少性別帶來的個(gè)體差異）。所有動(dòng)物模型制備過程執(zhí)行《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證管理辦法》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)分配到對照組（n=9）及模型組（n=36）。模型組根據(jù)HI后MR掃描時(shí)間段又進(jìn)一步分成6個(gè)亞組（0～2 h，n=4；2～6 h，n=5；6～12 h，n=6；12～24 h，n=5；24～48 h，n=7；48～72h，n=9）。 本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號為：2015PS337K）。

1．2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱?/h3>

1．2．1 對照組

室溫保持在28～30℃，臀部肌肉注射速眠新（0．6 mL/kg）麻醉新生豬。麻醉過程中密切觀察動(dòng)物的生命體征，一旦發(fā)現(xiàn)動(dòng)物陷入昏迷并且伴有肌肉松弛、四肢肌張力減低及角膜反射遲鈍，立即將新生豬以仰臥位固定在操作臺(tái)上實(shí)施手術(shù)。首先，在喉鏡引導(dǎo)下對新生豬實(shí)施氣管插管 （φ2．5 mm），連接TKR－200C小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，通入100%氧氣，呼吸機(jī)通氣參數(shù)值被設(shè)置為呼吸比 （1/E）1∶1．5，呼吸頻率30次/min。應(yīng)用 TuffSat手掌式脈搏血氧儀（美國GE公司）監(jiān)測心率和血氧飽和度。在對切口部位及周圍皮膚進(jìn)行消毒后，頸正中切口，將雙側(cè)頸總動(dòng)脈及毗鄰的頸內(nèi)靜脈與迷走神經(jīng)分離開來，留置5．0 mm絲線。對照組僅進(jìn)行手術(shù)，不進(jìn)行HI過程。

1．2．2 HI模型組

模型組新生豬進(jìn)行上述相同過程，待動(dòng)物狀態(tài)穩(wěn)定30 min后，用小動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，阻斷雙側(cè)頸動(dòng)脈血流，同時(shí)機(jī)械通入6%含氧混合氣，持續(xù)40 min。然后停止HI過程，撤去動(dòng)脈夾，恢復(fù)雙側(cè)頸動(dòng)脈血流，重新機(jī)械通入100%氧氣，縫合切口。建模過程中注意對新生豬生命狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)控。同時(shí)若術(shù)中及術(shù)后發(fā)生休克及抽搐應(yīng)及時(shí)處理[4－5]。術(shù)后，將動(dòng)物轉(zhuǎn)移至恒溫箱（37℃）內(nèi)，以保持術(shù)后恢復(fù)期間動(dòng)物體溫維持在正常范圍內(nèi)。自主呼吸恢復(fù)后停用呼吸機(jī)。注意在MR掃描時(shí)應(yīng)保持體溫，避免溫度波動(dòng)給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來偏差。MR成像時(shí)對未恢復(fù)自主呼吸的采用人工抱球法維持呼吸[4，6－7]。

1．3 1H－MRS 掃描及數(shù)據(jù)處理

采 用 Philips 3．0T MRI （Achieva 3．0T TX；Philips Healthcare Systems，Best，the Netherlands）進(jìn)行掃描，筆形束，二階勻場。體線圈發(fā)射，八通道頭線圈（Sense）接收。MRS采用單體素長TE掃描：TR/TE=2 000 ms/144 ms，NSA=64，VOI=10 mm×10 mm×10 mm。 感興趣區(qū)（Regions of interest，ROI）選擇右側(cè)基底節(jié)（圖1）。每只新生豬在HI后按分組中規(guī)定的各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行MR掃描。掃描獲得的波譜數(shù)據(jù)通過 （Linear combination of Model in vitro spectra,LcModel）進(jìn)行后處理（NAA 位于 2．02 ppm，Cr位于3．02 ppm，Cho 位于 3．2 ppm，Lac 位于 1．33 ppm，Tau包含兩組波峰，分別位于3．25ppm及3．42ppm附近）。

圖1 1H－MRS成像ROI的定義。采用T2WI圖像橫斷位進(jìn)行ROI選擇，右側(cè)基底節(jié)區(qū)作為1H－MRS ROI。Figure 1. Definition of ROIs in 1H－MRS．Illustration of the ROI in MRS scanning．For all animals,the right basal ganglion is selected as the ROI(T2WI image served as reference for the selection of ROIs in this study)．

1．4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用ANOVA方差分析比較對照組及HI模型組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的基底節(jié)區(qū)Tau蛋白含量及Glu含量的表達(dá)是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；采用Spearman相關(guān)分析對Tau蛋白含量及Glu含量進(jìn)行相關(guān)性分析，其中P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 基底節(jié)區(qū)Tau蛋白含量

HI再灌注后，各時(shí)間點(diǎn)Tau蛋白含量均值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在24～48 h達(dá)到最高值，均值在48～72 h隨時(shí)間稍有下降（圖2）。除0～2 h組Tau蛋白含量與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外（P=0．243），其余各組與對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0．05）。Tau蛋白含量最高點(diǎn)24～48 h組除與48～72 h無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，與對照組及模型組其余各時(shí)間點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。

圖2 對照組及模型組基底節(jié)區(qū)Tau蛋白表達(dá)隨時(shí)間變化趨勢。Figure 2. Tau content changes in basal ganglia within control group and HI group．

對照組及HI模型組部分時(shí)間點(diǎn)1H－MRS掃描數(shù)據(jù)經(jīng)Lcmodel擬合曲線如圖3所示。

2．2 基底節(jié)區(qū)Glu含量

HI再灌注后，Glu含量呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，繼而又上升，即“雙峰”樣變化，在 6～12 h、24～48 h達(dá)到峰值后的12～24 h及48～72 h隨時(shí)間稍有下降（圖 4）。 6～12 h、24～48 h 兩次峰值與對照組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。模型組中各時(shí)間點(diǎn)Glu含量與對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。

2．3 HI后基底節(jié)區(qū)Tau與Glu變化的相關(guān)性

HI后，基底節(jié)區(qū)Tau蛋白含量與Glu含量隨時(shí)間變化成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 0．76（P=0．00）（圖 5）。

圖3 對照組及模型組部分時(shí)間點(diǎn)內(nèi)Tau蛋白1H－MRS（經(jīng)LcModel軟件處理）結(jié)果。圖3a～3d分別為對照組及HI后16 h、35 h、68 h右側(cè)基底節(jié)1H－MRS的譜線（圈內(nèi)所示為Tau峰，位于3．25 ppm及3．42 ppm附近）。HI后16 h、35 h Tau峰升高，68 h可見Tau峰稍下降。Tau蛋白含量分別為 0 mmol/kg、0．68 mmol/kg、2．58 mmol/kg、1．997 mmol/kg。Figure 3. Results of Tau content and1H－MRS data at selected time points sample data analyzed by LCModel in control and study group．Figures 3a～3d are the1H－MRS spectral curves of the right basal ganglion analyzed by LCModel in the control group and the HI group at 16 h,35 h and 68 h,respectively．At 16 h and 35 h after HI insult,the Tau peaks(3．25 ppm,3．42 ppm)are markedly elevated;at 68 h,the Tau peak is lower than 35 h group．Tau concentration are 0 mmol/kg,0．68 mmol/kg,2．58 mmol/kg,1．997 mmol/kg respectively．

3 討論

新生兒出生后腦組織發(fā)育主要包括神經(jīng)細(xì)胞的增殖及髓鞘形成。Kreis等[8]發(fā)現(xiàn)，不同孕齡正常新生兒腦內(nèi)不同部位Tau含量不同，同時(shí)Huppi等[9]也證實(shí)足月兒及早產(chǎn)兒腦內(nèi)Tau蛋白水平不同，但是二者Tau蛋白的含量均隨著年齡增長逐漸上升至成人水平。

圖4 對照組及HI模型組基底節(jié)區(qū)Glu含量隨時(shí)間變化趨勢（橫線表示均值）。在HI后Glu首先出現(xiàn)上升，于6～12 h及24～48 h兩次達(dá)到高峰，繼而逐漸下降。Figure 4. Glu changes in basal ganglia within control group and HIBI group．The Glu peak increases 6～12 h,24～48 h after HI．The level of Glu gradually decreased．

圖5 HI后Tau含量與Glu含量變化的相關(guān)性。圖5a為Tau蛋白含量與Glu含量在HI后不同時(shí)間段內(nèi)隨時(shí)間變化的趨勢（各點(diǎn)表示均值；左側(cè)Y軸及黃線表示Tau含量，右側(cè)Y軸及粉線表示Glu含量）；圖5b為HI后Tau蛋白含量與Glu呈線性正相關(guān)，Spearman 相關(guān)系數(shù)為 0．76。Figure 5.Correlation of changes in content of Tau and Glu after HI．Figure 5a:The mean value of time varying between Tau and Glu in different time periods after HI(Each point represents the mean value．The left Y－axis and yellow line indicate the content of Tau,and the right Y－axis and pink line indicate Glu content)．Figure 5b:After HI,there is a positive linear correlation between Tau and Glu,and the correlation coefficient of Spearman is 0．76．

Glu為腦內(nèi)含量較多的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在突觸信號傳遞過程中發(fā)揮著重要作用[10－12]。生理情況下，Glu參與調(diào)控發(fā)育腦中少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的形態(tài)分化，是髓鞘發(fā)育的必要條件[13]。Tau蛋白是腦內(nèi)含量最多的微管相關(guān)蛋白（Microtubule－associated proteins，MAPs），生理功能是促進(jìn)微管形成及穩(wěn)定微管[14－15]。Tau蛋白含量的病理性表達(dá)及異常磷酸化是HI后影響髓鞘化的重要因素。

研究證實(shí)，Glu代謝障礙可導(dǎo)致Tau蛋白出現(xiàn)異常過度磷酸化及神經(jīng)毒作用[16－18]。由于HI后，小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量Glu，并激活少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞上的海人藻酸受體（KAR）和α－氨基－3羥基－5甲基－4異惡唑受體（AMPARS），介導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，此外，還可以激活星形膠質(zhì)細(xì)胞上的 N－甲基－D－天門冬氨酸（N－methyl－d－aspartic acid receptor，NMDAR），使臨近的少突膠質(zhì)細(xì)胞由NMDAR介導(dǎo)的興奮性Ca2+通路激活，導(dǎo)致Ca2+超載，介導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞壞死，Glu的興奮性毒作用是少突膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞死亡的重要機(jī)制[19－20]。在HI條件下，無氧酵解可引起乳酸中毒，這種缺氧狀態(tài)會(huì)直接導(dǎo)致神經(jīng)元壞死[21]。神經(jīng)元損傷后，Tau蛋白可從神經(jīng)元胞體釋放，可從微管上脫落，因此，受損細(xì)胞數(shù)量越多、損傷程度越重，Tau蛋白釋放就越多，游離的Tau蛋白也越多，引起腦組織中 Tau蛋白含量升高[22－23]，由此可見，Tau蛋白含量可反映神經(jīng)系統(tǒng)的損傷程度。

通過本研究結(jié)果可見，HI后，Glu及Tau蛋白均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，Glu及Tau蛋白呈顯著正相關(guān)（r=0．76）。HI后，Glu 濃度升高，Tau 蛋白釋放增加，Glu與Tau蛋白具有共同作用，過度磷酸化的Tau蛋白可引起線粒體功能障礙，同時(shí)可引起興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能受損，Glu在突觸部位的清除能力降低并逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致細(xì)胞外Glu大量聚集。

有研究表明，HI大鼠腦內(nèi)皮質(zhì)和腦室周圍白質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量與Tau蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)[24]，其可能的機(jī)制是HI后神經(jīng)細(xì)胞死亡釋放了Tau蛋白所致。而微管結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞體與神經(jīng)纖維之間的物質(zhì)傳遞障礙，從而造成神經(jīng)細(xì)胞的壞死與凋亡及神經(jīng)纖維的變性。

本研究中，HI后12～24 h，Glu濃度有個(gè)短暫的低峰，這是因?yàn)榇藭r(shí)負(fù)責(zé)將胞外Glu重新攝取回到星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用，將多余的 Glu 轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺（Gln），并通過“Glu（in neuron）－Gln（in astrocyte）”循環(huán)返回神經(jīng)元[25]，繼而又升高可能是由于再灌注損傷引起細(xì)胞破裂導(dǎo)致Glu釋放增加所致[26]。

本研究發(fā)現(xiàn)Tau蛋白升高后繼而稍微降低，與Franz等[27]觀察到的腦損傷后Tau蛋白先升高后降低的趨勢相似，這可能是由于長時(shí)間HI，導(dǎo)致腦組織細(xì)胞死亡數(shù)量增加，Tau合成減少以及分解增加所致。

本研究選擇基底節(jié)作為ROI，采用1H－MRS成像結(jié)合Lcmodel軟件處理，分析HI后Tau蛋白含量及Glu含量的變化的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)二者的變化呈正相關(guān)，HI后共同調(diào)節(jié)腦內(nèi)病理生理變化，分析了HI再灌注后神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)機(jī)制，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。