內質網應激和自噬的交互作用及其在阿爾茨海默病進展與防治中的作用

黃倩倩，溫彬宇，閆 妍，趙永烈，馬 濤

(1. 北京中醫藥大學第三附屬醫院腦病科，北京 100029；2. 北京中醫藥大學東方醫院實驗中心，北京 100078)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)起病隱匿，是一種以進行性記憶力喪失、認知功能障礙、人格和行為異常等為主要臨床表現的神經退行性疾病，主要病理改變包括以β淀粉樣蛋白(amyloid β, Aβ)沉積為主要成分的老年斑(senile plaque, SPs)和異常磷酸化Tau蛋白聚集形成的神經纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFTs)[1]。內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是細胞針對外界損傷的一種保護性機制，在AD病程中，Aβ和NFTs的過度累積均可激活ERS，引發未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)，進而激活自噬，清除錯誤折疊蛋白[2]。大量研究顯示，在AD中，由于ERS的持續激活及自噬功能障礙，導致過量累積的Aβ與NFTs不能被有效清除，從而造成神經元損傷，導致認知記憶功能障礙[3]。近年研究發現，ERS與自噬的交互作用在AD發病及治療中發揮關鍵作用，成為AD治療的重要潛在靶標，受到日益關注。本文主要針對近年來ERS與自噬交互作用在AD發病及防治中的作用機制及研究進展做一綜述。

1 ERS與AD

內質網是真核細胞中負責膜蛋白合成、初始翻譯后修飾、折疊和分泌的細胞器。當未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網腔中積累，內質網蛋白折疊功能過載時，會造成內質網穩態失衡，誘發ERS，進而激活UPR，引發下游一系列反應[4]。UPR分別由3個跨膜感受蛋白介導的通路啟動，這3個蛋白分別是蛋白激酶樣內質網激酶[protein kinase RNA (PKR)-like ER kinase, PERK]、肌醇需求酶1α(inositol-requiring enzyme 1α, IRE1α)和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)。在正常生理狀態下，這3種蛋白均與葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)結合，保持無活性狀態。ERS發生時，PERK、IRE1α、ATF6與GRP78解離并被激活，啟動UPR，上調包括分子伴侶在內的UPR相關基因表達，下調總體蛋白質翻譯水平，以恢復內質網內環境穩態，保護細胞功能[5]。

大量研究證明，ERS是AD的核心病變。在AD患者大腦中，ERS標志物GRP78水平明顯增高，并且與AD患者的Braak分期呈正相關；UPR中關鍵蛋白，包括磷酸化的PERK、真核翻譯啟始因子2α(eucaryotic translation initiation factor 2α, eIF2α)、IRE1α等水平，在AD患者腦中均明顯增加。研究表明，UPR發生在AD早期階段，隨著病情加重，內質網穩態持續失衡，適應性、保護性ERS逐漸轉變為持續性、損傷性ERS，造成神經元凋亡和突觸缺失，損害認知和學習記憶能力[3]。Marcora等[6]發現，伴隨著AD模型果蠅的衰老，UPR的保護作用減弱，而PERK持續磷酸化導致的神經變性損傷明顯增強，ERS由適應性、保護性向持續性、損傷性轉變。AD患者及模型小鼠腦中，eIF2α持續磷酸化導致的持續性ERS，可抑制突觸蛋白的合成，降低神經突觸可塑性，加重記憶功能障礙[7]。

Aβ的毒性積聚是AD病變的重要因素，Aβ的過量累積可導致SPs形成，造成突觸缺失、神經功能失調和神經元死亡。內質網內環境與Aβ產生和加工密切相關，Aβ是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)通過β-分泌酶1(beta-secretase 1, BACE1)和γ-分泌酶依次剪切形成的短肽。正常細胞中，APP與GRP78結合，從而抑制Aβ產生；而在AD病理狀態下，由于ERS失衡，APP轉運異常，造成APP的異常積聚。Liu等[8]發現，衣霉素誘導的ERS使AD模型細胞UPR被激活，APP水平下降；但當ERS平衡破壞后，BACE1和γ-分泌酶復合物的核心組分-早老素1(presenilin 1，PS1)的表達會隨之上調，致使Aβ生成增加，并進一步累積。在AD模型小鼠中，隨著eIF2α磷酸化水平的增高，活化轉錄因子4(activating transcription factor 4, ATF4)和BACE1的表達水平也隨之上升，Aβ生成和SPs沉積明顯增加[9]。

PS1基因突變是AD的重要遺傳致病因素，可以對ERS產生多種影響。PS1突變可以使GRP78的水平降低，抑制IRE1α、PERK的自身磷酸化和減弱ATF6信號通路，進而削弱UPR保護作用，導致ERS失衡，增加神經元對ERS損傷的易感性，進一步加重AD病理損傷[3]。Genereux等[10]發現在AD中，ERS激活ATF6信號通路后，PS1突變使分子伴侶ERdj3(ER-localized DnaJ homolog 3)的產生減少，導致Aβ分泌到胞外，并形成毒性聚集，破壞神經元功能，進而削弱UPR對內質網穩態的再平衡作用。

2 自噬與AD

細胞自噬是維持細胞內穩態，降解錯誤折疊蛋白和受損細胞器的重要代謝過程，是實現細胞自我更新的一種重要機制[3]。自噬根據降解途徑的不同分為3類，即分子伴侶介導的自噬 (chaperon-mediated autophagy，CMA)、微自噬(microautophagy)和巨自噬(macroautophagy)。巨自噬主要通過自噬溶酶體來清除錯誤折疊蛋白質，以維持細胞穩態，本文所涉及的自噬主要是巨自噬。巨自噬對于神經元維持內穩態發揮著至關重要的作用，影響其功能的關鍵步驟主要是自噬體在神經元內的運輸，以及自噬體與溶酶體的融合。自噬過程受到多種信號通路的調控。

自噬功能障礙與AD發病過程密切相關，自噬是清除異常錯誤蛋白聚集體的重要途徑，健康神經元中的自噬囊泡通過與溶酶體結合，降解錯誤蛋白；而在AD中，自噬功能出現障礙，自噬囊泡大量累積，這可能是Aβ和磷酸化Tau蛋白異常累積的重要原因[11]。自噬溶酶體系統是Aβ的主要降解途徑，在正常情況下，Aβ被自噬囊泡包裹后，自噬囊泡沿軸突的微管系統逆向運輸到溶酶體部位，與之融合并降解Aβ。研究發現，AD患者中樞神經元的部分軸突和樹突部位，自噬囊泡由于運輸障礙導致大量堆積，造成自噬功能損傷，使軸突和樹突部位異常腫脹[15]。同時，溶酶體功能障礙也是導致AD自噬功能障礙的重要原因，會造成自噬系統降解Aβ能力下降，Aβ無法有效清除而積聚，從而加劇AD病理損傷。研究表明，在溶酶體特異性水解酶組織蛋白酶B(cathepsin B)基因敲除小鼠腦中，Aβ產生明顯增多；在AD患者及模型動物腦中，溶酶體功能異常往往出現于Aβ形成和AD臨床癥狀出現之前，提示溶酶體功能損傷導致的自噬障礙發生在AD早期[12]。

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、微管相關蛋白1輕鏈3蛋白[microtubule-associated protein 1 (MAP1) light chain 3, LC3]和自噬激活蛋白Beclin-1等參與自噬調節的關鍵蛋白，均與AD的發生存在密切關系。mTOR對自噬發揮負調控作用，抑制mTOR，可以啟動細胞自噬反應。Aβ沉積可以誘導mTOR信號激活，從而抑制自噬反應。通過mTOR誘導的自噬可以清除Aβ毒性蛋白質聚集體，發揮神經保護作用，是AD防治的重要靶標。 Majumder等[13]發現，抑制mTOR可以激活自噬通路，使UNC-51樣激酶1(UNC-51 like kinase 1, ULK1)激酶復合物去磷酸化后激活，招募磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidyl inositol 3 kinase, PI3K)復合物到內質網。使自噬相關蛋白(autophagy-related, ATG)12與 ATG5蛋白偶聯，進而使LC3-I蛋白與磷脂酰乙醇胺結合，形成LC3-II，形成自噬小體，清除Aβ蛋白沉積和Tau形成的NFTs，減輕認知功能損傷。Beclin-1是激活自噬過程的重要調控因子，在Beclin-1敲除小鼠受影響的大腦區域中，神經元的自噬調節被破壞，影響APP代謝，導致細胞外Aβ蛋白異常沉積，提示上調Beclin-1對防止AD早期病變發揮重要作用。

Fig 1 Crosstalk of ERS and autophagy in AD progress

3 內質網應激和自噬的交互作用與AD發生、發展的關系

ERS下的大量錯誤折疊蛋白累積引起的UPR可激活細胞自噬，而細胞自噬通過降解錯誤蛋白，恢復內質網穩態，反過來抑制ERS，減少細胞凋亡，促進細胞生存。由此，ERS與自噬的適度激活形成了機體內適應性、保護性的交互作用[14]。在AD發病過程中，這種適應性、保護性的交互作用逐漸轉變為一種持續性、破壞性的交互作用(Fig 1)。其中，PERK、IRE1α及ATF6信號通路介導的ERS和自噬的交互效應，在AD發生、發展中發揮了重要的核心作用(Fig 2)。

Fig 2 Pathways involved in crosstalk between ERS

3.1PERK/eIF2α介導的ERS和自噬交互作用許多研究證明，PERK/eIF2α途徑是介導ERS與自噬交互作用的重要調控因子。Rouschop等[15]發現，PERK信號通路激活的ATF4和CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologuous protein, CHOP)，能夠上調自噬相關蛋白LC3B和ATg5基因的轉錄，從而促進自噬體的形成。ERS還能夠通過eIF2α-ATF4-CHOP途徑，調控自噬蛋白ATG12，促使 LC3I轉變為 LC3II，誘發細胞自噬。PERK是激活eIF2α的重要激酶，與細胞的自噬反應密切相關。在AD中，持續性ERS激活PERK-eIF2α信號通路，磷酸化eIF2α上的51位絲氨酸，下調總體蛋白質翻譯水平；激活的eIF2α上調ATF4 mRNA，進而上調CHOP等轉錄因子，抑制抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤蛋白2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)基因轉錄，上調Beclin-1表達，從而導致自噬啟動[9]。Urra等[16]發現，持續性ERS使CHOP持續上調，通過抑制Bcl-2和上調促凋亡蛋白Bcl-2相關蛋白x(Bcl-2-associated x, Bax)、Bcl-2同源拮抗蛋白(Bcl-2 homologous antagonist/killer, Bak),加速細胞凋亡，加重AD相關的神經變性和記憶障礙。持續性ERS導致eIF2α過度磷酸化，使細胞總體蛋白質合成下降，損害神經功能；同時上調BACE1，導致Aβ過量產生和SPs沉積[17]。在AD轉基因小鼠中，持續性激活的PERK-eIF2a能夠上調BACE1的表達，影響APP的加工過程，增加Aβ的沉積；累積的Aβ反過來進一步激活ERS，加重神經損傷[18]。AD中持續性自噬損傷導致Aβ降解能力下降，造成Aβ累積增加，反過來也會加重ERS。Ohta等[19]發現，Atg5基因敲除的HEK293細胞由于自噬功能障礙，會激活PERK/eIF2α途徑，導致ATF4激活，上調PS1表達，提高γ-分泌酶活性，增加Aβ生成，造成ERS持續激活。

3.2IRE1α介導的ERS和細胞自噬交互作用IRE1α信號通路介導的ERS和自噬的交互作用，與AD的病理過程密切相關。IRE1α是一種具有核酸內切酶活性的I型跨膜蛋白，在通過自身二聚化和磷酸化激活后，IRE1α對無活性的X-盒結合蛋白1(X box binding protein-1, XBP1)mRNA進行加工，使其翻譯成有活性的轉錄因子XBP1，可調節多個UPR靶基因的表達。另外，IRE1α信號通路激活的XBP1可增加ER中伴侶分子的表達，促進錯誤蛋白質的折疊和降解，以恢復內質網穩態。ERS激活的IRE1α信號通路與自噬的激活密切相關。IRE1α激活后，與腫瘤壞死因子受體相關因子2 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 2, TRAF-2)結合，募集凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1)，隨后激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase, JNK)，進而磷酸化Bcl-2，激活Beclin-1，誘發自噬反應。在AD中，由于Bcl-2磷酸化失活，導致神經元凋亡，加重AD神經損傷。Vogel等[20]發現，ASK1介導的JNK激活后，還可調節APP的加工，增加細胞內Aβ的積累，導致神經損傷。但同時在ERS中，XBP1與轉錄因子FOXO1的結合，會對自噬起到負性調節作用。Safra等[21]研究發現，秀麗線蟲AD模型中，敲除XBP1基因，可以上調自噬，減少Aβ毒性累積造成的損傷，表明XPB1是AD治療的重要潛在靶標。另外，XBP1還可以與γ-分泌酶復合體的負性調控因子UBQLN1基因啟動子結合，控制APP的分裝與加工，影響Aβ的生成。

3.3ATF6介導的ERS和細胞自噬交互作用ATF6信號通路在ERS與自噬的交互作用中發揮著重要作用。ATF6是II型跨膜蛋白，屬于亮氨酸拉鏈家族(bZIP)結構域中的轉錄因子，在內質網內，與GRP78結合而保持非活性狀態。ERS發生后，去除 GRP78的ATF6被轉運到高爾基體上，在高爾基體內，ATF6被特定的蛋白酶S1P(site 1 protease)和S2P(site 2 protease)切割后激活，之后移位到核內，參與調控多個UPR相關基因的表達。研究發現，ATF6激活后，可以上調UPR相關蛋白GRP78和葡萄糖調節蛋白94(glucose-regulated protein 94, GRP94)基因的表達，減弱神經元對ERS易感性，保護神經元，改善認知功能水平，顯示ATF6可以做為AD潛在治療靶標。有研究表明，在ERS導致的UPR中，ATF6上調死亡相關蛋白激酶1(death-associated protein kinase 1, DAPK1)，激活的DAPK1磷酸化Beclin-1，促進其與Bcl-2解離，激活自噬，同時促進細胞凋亡[3]。ATF6的激活上調DNA損傷誘導轉錄因子3(DNA damage inducible transcript 3, DDIT3)的表達，DDIT3可與自噬相關蛋白LC3B基因上游-253-99啟動子區結合，上調LC3B的表達，促進自噬。當AD發生時，持續性激活的ERS，導致ATF6信號通路受損，致使分子伴侶ERdj3的產生減少，導致Aβ生成增加，破壞神經元功能，加重AD病理損傷[10]。

4 結語與展望

綜上所述，ERS與自噬廣泛參與了AD的生理和病理過程，兩者的交互作用與AD的發生、發展密切相關。ERS與自噬適應性、保護性的交互作用可以幫助細胞清除毒性蛋白聚集體，減輕內質網腔內失衡壓力，恢復細胞穩態。在AD中，內質網穩態的持續失衡和自噬功能障礙，導致ERS與自噬之間的上述交互作用逐漸轉變為一種持續性和破壞性的交互作用。AD中，自噬功能障礙導致Aβ及NFTs降解下降并異常累積，反過來進一步加重ERS的持續激活。首先，功能障礙的自噬長時間過度激活，導致自噬囊泡不斷聚積，被損害的自噬溶酶體系統面臨重大負荷，損傷神經元；其次，eIF2α的持續磷酸化，使蛋白總體合成減少，導致神經元正常生理活動受阻，損害神經系統功能，如eIF2α的持續磷酸化可使突觸相關蛋白表達下降，破壞突觸可塑性[7]；再次，eIF2α的持續磷酸化導致BACE1上調，使Aβ產生增加和過量累積形成SPs，破壞神經功能；最后，ERS與自噬的惡性循環激活凋亡信號通路，誘導神經元凋亡，加重神經變性，推動AD病程惡化(Fig 1)。

由于ERS與自噬持續性、破壞性的交互作用在AD發生及進展中的核心作用，因此成為當前AD防治極有價值的潛在靶標，為AD治療和干預開辟了新的思路。針對PERK/eIF2α通路調控，Halliday等[22]發現ATF4抑制劑ISRIB可以下調 ATF4表達，恢復細胞蛋白合成水平，明顯提高大鼠的認知能力，且ISRIB能透過血腦屏障，表現出良好的生物利用度。小分子物質Salubrinal和Sephin 1通過阻止eIF2α磷酸化，抑制ERS，提高蛋白合成水平，恢復自噬功能，發揮神經保護作用[23]。研究發現，針對IRE1α核酸內切酶活性的抑制劑，如4μ8c、MKC-3946、SFT-083010、色霉素A3和ATP-競爭性抑制劑如APY29、sunitinib，以及天然活性物質如槲皮素、白藜蘆醇等，均可以通過調控IRE1α通路，調節ERS，發揮治療作用，體現出巨大的潛在臨床應用價值[24]。直接調控ATF6表達或活性的化合物，目前還未見報道，但研究表明，Nucleobindin 1可以通過抑制SP1活性，阻止ATF6活化。大量抗氧化活性的天然產物，如黃酮類的堪非醇等，可以通過下調ATF6，保護機體免受ERS過度激活的損傷，具有很好的臨床應用前景[25]。

綜上所述，ERS與自噬的持續性、破壞性交互作用是AD發生、發展的重要因素，針對這一病理過程進行干預，對于緩解AD病程具有重要意義，因此成為治療AD極具應用前景的藥物靶標，為未來AD治療藥物的研發指明了重要方向。