注射用核糖核酸Ⅱ對人橫紋肌肉瘤細胞增殖和凋亡的調控作用

單 宇，白雪蓮,2，楊淑賢，韓嘉媛，趙青舟，包曉威,2，李立勇，曹 麗

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100193；2.哈爾濱商業大學生命科學與環境科學研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076)

人橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RMS)來源于橫紋肌細胞或向橫紋肌細胞分化的間葉細胞，分化程度低而惡性程度高[1]。其發病率僅次于惡性纖維組織細胞瘤和脂肪肉瘤，位居軟組織肉瘤的第3位。RMS主要分為3個亞型，分別為胚胎型橫紋肌肉瘤(embryonal rhabdomyosarcomas，ERMS)、腺泡型橫紋肌肉瘤(alveolar rhabdomyosarcoma，ARMS)和多形性橫紋肌肉瘤(pleomorphic rhabdomyosarcoma，PRMS)[2]。ERMS好發于嬰兒及兒童期，平均發病年齡為5歲，約占RMS的2/3。而ARMS好發于青少年，PRMS多發于成年。ERMS是兒童期最常見的一種高度惡性的軟組織肉瘤，若手術能夠完全切除，可達到較好的效果，但由于多種因素限制，僅有10%的患者能夠完全切除。且ERMS易發生轉移，在手術切除后必須結合后續治療，目前，臨床上仍采用放療和細胞毒藥物化療等手段，對兒童的生長發育極為不利，需要尋找新的治療藥物。

注射用核糖核酸Ⅱ是一種上市多年的核酸類抗腫瘤藥物，主要成分為牛胰臟組織提取的高純度低分子RNA，廣泛用于胰腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、軟組織肉瘤等多種癌癥的治療。目前，關于注射用核糖核酸Ⅱ的文獻報道多來自臨床病例，關于其作用機制的研究依然缺乏。前期在多種細胞系的篩選實驗中發現，人白血病K562細胞、人惡性胚胎橫紋肌瘤RD細胞對注射用核糖核酸Ⅱ較為敏感，對于K562細胞的作用已有相關研究文獻[3]，而對于RD細胞的研究尚未見報道。因此，本研究探討注射用核糖核酸Ⅱ對RD細胞的作用。

1 材料

1.1藥物與試劑注射用核糖核酸Ⅱ(規格50 mg)由吉林敖東藥業提供；MTT(美國Sigma公司)；Hoechst 33258、JC-1、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；吖啶橙(AO)/溴化乙錠(EB)雙染試劑盒(美國Amresco公司)；RIPA高效裂解液、PMSF、BCA蛋白檢測試劑盒、DMEM高糖培養基(北京索萊寶科技有限公司)；特級胎牛血清(加拿大Wisent公司)；ECL顯色試劑盒(康為世紀生物技術有限公司)；β-actin、p-Akt、Bax、Bcl-2、caspase-8、caspase-3、羊抗兔IgG抗體(美國CST公司)；p-JNK、p21、周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)、CDK4抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2儀器CO2細胞培養箱(日本Panasonic公司)；Infinite M200 PRO酶標儀(瑞士Tecan公司)；臺式高速冷凍離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；熒光顯微鏡(Life公司)；高內涵成像系統(美國Molecular Devices公司)；流式細胞分析儀(美國Becton-Dickinson公司)；垂直電泳儀(上海天能科技有限公司)；凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1細胞培養RD細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，培養在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，每天換液1次，2～3 d傳代1次。

2.2注射用核糖核酸Ⅱ貯備液的配制每次加藥前，將1支注射用核糖核酸Ⅱ(50 mg凍干粉針劑)溶于5 mL的無菌DEPC水中，配制成濃度為10 g·L-1的貯備液，備用。

2.3MTT法檢測RD細胞存活率將處于對數生長期且狀態良好的RD細胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，充分吹打混勻后計數，并用完全培養基將其稀釋至8×107·L-1，以每孔0.1 mL接種到96孔板中，繼續培養24 h后，用完全培養基對注射用核糖核酸Ⅱ貯備液進行稀釋，各孔按組別加藥0.1 mL(每組設4個復孔，下同)，使藥物終濃度分別為0、50、100、200、400、800 mg·L-1，作用24 h后，每孔加入5 g·L-1的MTT溶液10 μL，小心混勻，充分反應4 h后，棄去細胞上清液，加入150 μL DMSO，酶標儀震蕩120 s，570 nm處測定吸光度(A)值，計算細胞存活率。根據細胞存活率結果計算半數抑制濃度(IC50)，并確定給藥濃度。細胞存活率=(A給藥組-A空白組)/(A正常組-A空白組)×100%。

2.4Hoechst33258染色法檢測RD細胞凋亡取處于對數生長期的RD細胞，胰酶消化，吹勻計數后，將細胞懸液稀釋至5×108·L-1，以每孔1 mL接種于6孔板中，24 h后，分別加入不同濃度的含藥完全培養基1 mL，使終濃度為125、250、500 mg·L-1，藥物作用24 h，PBS洗2次，加入Hoechst 33258染色液0.5 mL，避光染色15 min，PBS洗掉多余染料。置于熒光顯微鏡下，觀察并拍照。

2.5AO/EB雙染法檢測RD細胞凋亡按照“2.4”項下同樣的方法，接種細胞并給藥，藥物作用24 h后，PBS洗2次，加入AO ∶EB=1 ∶1的混合染色液0.5 mL，輕柔混勻，避光染色15 min，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6JC-1法檢測RD細胞內線粒體膜電位嚴格按照JC-1試劑盒說明書配制各工作液。按照“2.3”項下同樣的方法接種細胞，24 h后，分別加入不同濃度的含藥完全培養基0.1 mL，使終濃度為125、250、500 mg·L-1，藥物作用24 h后，加入0.1 mL的JC-1染色工作液，充分混勻，37 ℃避光孵育20 min后，棄去上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次。用熒光酶標儀檢測熒光強度，490 nm/530 nm檢測綠色熒光，525 nm/590 nm檢測紅色熒光，線粒體膜電位結果以紅色/綠色熒光信號強度的比值表示。采用高內涵成像系統拍照。

2.7流式細胞術檢測RD細胞周期分布按照“2.4”項下同樣的方法接種細胞并給藥，24 h后，用胰蛋白酶消化收集細胞，與細胞上清液合并，1 500 r·min-1離心5 min，預冷的PBS洗2次，用體積分數為70%的冰乙醇小心混勻，-20 ℃固定過夜。離心，棄去乙醇固定液，PBS洗2次，棄上清，加入按照說明書配制好的碘化丙啶染色液0.5 mL，37 ℃避光染色30 min后，用流式細胞儀檢測細胞周期。

2.8Westernblot檢測RD細胞蛋白表達變化按照“2.4”項下同樣的方法接種細胞并給藥，24 h后，用胰蛋白酶消化收集各組細胞，與細胞上清液合并，1 500 r·min-1離心5 min，PBS洗2次。按體積比為RIPA ∶PMSF ∶蛋白磷酸酶抑制劑=98 ∶1 ∶1的比例配制裂解液，適量加入細胞中，充分渦旋，置于冰上，裂解40 min，20 min時重復渦旋混勻1次，12 000 r·min-1離心10 min，上清液即為細胞總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。按每孔45 μg上樣，80 V進行SDS-PAGE凝膠電泳，300 mA恒流將已分離的蛋白條帶轉移到PVDF膜上，在質量分數5%的脫脂牛奶中封閉2 h，分別以1 ∶2 000稀釋p-Akt、Bax、Bcl-2、caspase-8、caspase-3、β-actin抗體，以1 ∶500稀釋p-JNK、p21、CDK2、CDK4抗體，置4 ℃孵育過夜。TBST洗3次后，二抗孵育2 h，TBST洗3次，加入ECL試劑使條帶充分顯色，于凝膠成像系統進行掃描并拍照，配套軟件檢測灰度值，各條帶灰度值與對應β-actin灰度值的比值為該蛋白相對表達量。

3 結果

3.1注射用核糖核酸Ⅱ抑制RD細胞的增殖如Fig 1所示，注射用核糖核酸Ⅱ給藥24 h后，與正常組(即給藥濃度為0 mg·L-1)相比，各給藥組細胞存活率明顯降低(P<0.01)，且細胞存活率與給藥濃度呈負相關，表明注射用核糖核酸Ⅱ對RD細胞增殖有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性。經計算，IC50為222 mg·L-1。因此，確定后續實驗低、中、高給藥組濃度分別為125、250、500 mg·L-1。

**P<0.01vscontrol

3.2注射用核糖核酸Ⅱ可誘導RD細胞凋亡

3.2.1 Hoechst 33258染色法 如Fig 2所示，注射用核糖核酸Ⅱ給藥24 h后，正常組細胞呈現正常的藍色熒光，而各給藥組細胞藍色熒光出現不同程度的致密濃染，顏色發白，提示細胞進入凋亡狀態。

Fig 2 RD cell apoptosis detected by Hoechst 33258 staining

A: 0 mg·L-1; B: 125 mg·L-1; C: 250 mg·L-1; D: 500 mg·L-1.

3.2.2 AO/EB雙染法 如Fig 3所示，注射用核糖核酸Ⅱ給藥24 h后，正常組細胞的胞核呈現有層次的綠色熒光，細胞形態完整，未見凋亡。各給藥組細胞熒光強度增加，呈均勻一致的圓狀、團塊狀結構，出現明顯的橘紅色熒光，隨著濃度的增加，橘紅色熒光比例同時增加，表明注射用核糖核酸Ⅱ能夠濃度依賴性地誘導RD細胞凋亡。

Fig 3 RD cell apoptosis detected by AO/EB staining

A: 0 mg·L-1; B: 125 mg·L-1; C: 250 mg·L-1; D: 500 mg·L-1.

3.3注射用核糖核酸Ⅱ降低RD細胞線粒體膜電位JC-1拍照(200倍)及線粒體膜電位統計結果見Fig 4，與正常組相比，隨著給藥濃度的增加，各給藥組綠色熒光相應增強，紅色熒光相應減弱，紅色/綠色熒光強度比值明顯降低(P<0.01)，表明注射用核糖核酸Ⅱ能夠明顯降低RD細胞線粒體膜電位，且呈濃度依賴性。

Fig 4 Results of mitochondrion membrane potential(×200)

A: 0 mg·L-1; B: 125 mg·L-1; C: 250 mg·L-1; D: 500 mg·L-1.**P<0.01vscontrol.

Fig 5 Effect of ribonucleic acid Ⅱ on RD cell cycle distribution

A: 0 mg·L-1; B: 125 mg·L-1; C: 250 mg·L-1; D: 500 mg·L-1.

3.4注射用核糖核酸Ⅱ將RD細胞周期阻滯在S期流式細胞術檢測細胞周期分布的結果見Fig 5，各時期細胞所占比例見Tab 1。與正常組相比，給藥24 h后，各給藥組G0/G1期細胞比例明顯降低，S期細胞比例明顯增加(P<0.01)，表明注射用核糖核酸Ⅱ將RD細胞的染色體復制過程阻滯在S期。

Tab 1 Ratio of RD cell cycle distribution afterribonucleic acid Ⅱ treatment for 24

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.5注射用核糖核酸Ⅱ對細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響細胞周期相關蛋白表達結果見Fig 6。注射用核糖核酸Ⅱ對G1/S期關鍵蛋白信號通路發揮調控作用，與正常組相比，藥物明顯上調周期阻滯蛋白p21的表達，并下調CDK2、CDK4的表達，將細胞周期阻滯在G1/S期。如Fig 7所示，與正常組相比，注射用核糖核酸Ⅱ使RD細胞Akt、JNK磷酸化水平明顯降低，表明RD細胞的生長發育過程受到抑制。

凋亡相關蛋白表達結果見Fig 8。與正常組相比，注射用核糖核酸Ⅱ明顯下調抑凋亡蛋白Bcl-2表達，并上調促凋亡蛋白Bax的表達，caspase-8、caspase-3前體含量明顯降低(P<0.01)，表明二者被大量激活，RD細胞發生凋亡。

4 討論

在臨床中，注射用核糖核酸Ⅱ單用或聯合其他化療藥用于多種腫瘤治療，可改善癌癥患者生活質量，減輕由于放化療導致的不良反應及免疫細胞數量下降[4]。

Fig 6 Cell cycle-related protein expression after ribonucleicacid Ⅱ

**P<0.01vscontrol

據報道，注射用核糖核酸Ⅱ可增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力，改善順鉑導致的外周血白細胞數量減少，提升脾臟T細胞的增殖能力，且與順鉑協同抑制小鼠腹水瘤S180細胞的增殖[5]；通過抑制血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，抑制血管新生[6]；通過上調p53調控Bcl-2/Bax的功能，激活線粒體凋亡通路，誘導人白血病K562細胞凋亡[3]；降低周期調控關鍵蛋白cyclin D1的表達，將肝癌細胞的周期阻滯在G0/G1期，并下調基質金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase 3，MMP-3)，抑制肝癌細胞的侵襲和遷移[7]。

幾乎所有腫瘤的發生都與細胞周期相關，細胞周期的失控，導致腫瘤的發生。周期依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)是調控細胞周期的核心之一，其中以CDK4為主要因子，注射用核糖核酸Ⅱ對CDK4的下調直接導致了細胞周期的阻滯。

Fig 7 Proliferation-related protein expression afterribonucleic acid Ⅱ treatment for 24

**P<0.01vscontrol

Fig 8 Apoptosis-related protein expression afterribonucleic acid Ⅱ treatment for 24

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

p21是p53基因下游的CDKs抑制因子，注射用核糖核酸Ⅱ明顯下調了p21的表達，CDK2的表達隨之降低。CDK2、CDK4作為細胞周期信號通路的兩個節點蛋白，二者表達量降低直接影響了整個通路的信息傳遞，導致細胞周期被阻滯在G1/S期。流式細胞術結果也顯示，注射用核糖核酸Ⅱ主要將RD細胞阻滯在S期。

JNK是MAPK家族的成員之一，其主要的生物學功能為促進細胞的增殖發育，而不同細胞中JNK的生理功能有所不同。據報道，許多疾病的發生是由于JNK對正常細胞的促凋亡作用，如心肌細胞、神經細胞[8-10]等。而在一些腫瘤細胞中，JNK處于持續激活狀態[11-12],能夠促進腫瘤細胞的增殖。注射用核糖核酸Ⅱ通過抑制Akt、JNK的磷酸化，抑制了腫瘤細胞的增殖，對RD細胞生長發育產生抑制作用。

正常生理狀態下，Bcl-2可通過阻止該家族促凋亡蛋白Bax、Bak引起的DNA損傷，維持線粒體的完整性。實驗結果表明，注射用核糖核酸Ⅱ明顯下調了Bcl-2的表達，而Bax的表達量隨之上調，Bcl-2/Bax比值明顯降低，線粒體完整性被破壞。膜系統崩潰后，線粒體膜電位降低(與JC-1結果一致)，生命活動受到抑制，細胞進入凋亡早期[13]，隨后，線粒體基質內大量的凋亡因子釋放到細胞內。Caspase-8和caspase-3作為線粒體凋亡的起始者和執行者，其前體含量較正常組明顯降低，意味著二者已被大量激活，促進細胞凋亡的發生。

綜上，注射用核糖核酸Ⅱ通過上調p21的表達，抑制CDK2、CDK4的作用，將RD細胞的復制阻滯在S期；并通過調控Bcl-2/Bax，激活caspase-8、caspase-3，促進RD細胞凋亡，發揮抗人惡性胚胎橫紋肌瘤的作用。實驗中，注射用核糖核酸Ⅱ對一些信號分子的調控，可能是通過上游因子產生影響，也可能是直接產生調控作用，若要尋找其關鍵的作用位點，應排除因子間的相互干擾。另外，注射用核糖核酸Ⅱ為混合物，其具體的作用靶點仍未明確，就現有報道來看，其可能作用于腫瘤生長發育的多個環節，而其具體的作用靶點仍需進一步探究。

(致謝：本研究在中國醫學科學院藥用植物研究所藥理毒理中心曹麗課題組實驗室完成，衷心感謝實驗室各位給予的幫助！)