大黃素抑制脂多糖誘導星形膠質細胞炎癥反應的機制研究

林 昱，賴文芳，蘇燕青，宋百穎，黃 鑫，洪桂祝

(福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122)

在中樞神經系統中，星形膠質細胞是數量最多的一類功能調節細胞，在正常生理條件下，為神經元提供信息加工、支持及必要的營養，在維持內環境穩定的過程中起到重要的作用[1]。然而，由脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)或活化的小膠質細胞分泌的白細胞介素1α(interleukin 1α，IL-1α)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和C1q，能誘導靜息星形膠質細胞轉變為反應性星形膠質細胞，后者分泌補體C3、Fbln5等一系列蛋白及多種炎癥因子，包括IL-1β、IL-6、TNF-α等神經炎癥調節因子，使得星形膠質細胞失去正常的功能，并誘導神經元和少突膠質細胞死亡，加重腦神經炎癥的發展惡化[2]。因而，對星形膠質細胞的研究或將成為改變炎癥進程的新方向。

大黃素(emodin)是大黃的主要有效成分，也是大黃藥效物質基礎的重要標志物之一。大黃素分子量270.13 u，脂溶性高，有利于穿透血腦屏障，可明顯抑制腦組織炎性級聯反應，降低TNF-α和IL-1β的表達[3]。據文獻報道，大黃素能抑制由LPS誘導的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)炎癥因子(IL-6、IL-1β)和趨化因子(IL-8、CCL2)的表達，降低IκBα的降解和NF-κB活性[4]，這些結果提示大黃素具有抗炎和減少神經細胞凋亡的作用。本課題組前期研究發現，大黃素可促進腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的表達，顯現出一定的神經保護作用[5]。本研究采用大黃素干預LPS誘導的星形膠質細胞，探討大黃素對LPS誘導星形膠質細胞炎癥反應的調節及作用機制。

1 材料

1.1實驗動物健康成年的SPF級♀、♂SD大鼠，體質量(280±20)g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：2015000510392，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。于福建中醫藥大學醫學實驗動物中心飼養，許可證號：SYXK(閩)2014-0005，適應性喂養1周后合籠交配，取出生24 h內的乳鼠用于實驗。

1.2試劑大黃素(上海皇晶生物科技有限公司，純度≧98%)；LPS(Sigma，貨號：L2880)；DMEM/F12(HyClone，貨號：SH30023.01)；胎牛血清(Gibco，貨號：100099141)；細胞裂解液(碧云天生物技術有限公司，產品編號：P00013B)；ChamTM SYBR?qPCR Master Mix(南京Vazyme公司，批號：1604010)；RNeasy? Mini Kit(德國Qiagen公司，批號：151052173)；逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司，批號:00425005)；膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗體(貨號：ab7260)、熒光二抗(貨號：ab150077)，均購自Abcam公司；C3抗體(上海生工，貨號：D151005)；早期生長反應因子4(early growth response-4,Egr-4)抗體(Santa Cruz公司，貨號：sc-133540)；β-actin抗體(北京全式金生物技術有限公司，批號：k10601)；DAPI染色液(碧云天生物技術有限公司，貨號：C1005)；NO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號：A012)。

1.3儀器倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)；7900H熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；PrimoR高速臺式冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司)；酶標儀(TECAN公司)；Mini PROTEAN Tetra 小型垂直電泳槽、Mini Trans-Blot小型轉印槽、C1000 PCR儀、ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1原代星形膠質細胞的分離、培養將出生24 h之內的乳鼠置于75%乙醇中消毒后，使用小剪刀斷頭，沿囟門剪開顱骨，使其腦組織暴露，棄去小腦，剝去腦膜后取大腦皮層，用0.25%的胰蛋白酶消化10 min，使組織消化為細胞后，接種于用多聚賴氨酸包被的25 cm2培養瓶中，放于37 ℃細胞培養箱內，使用含10%胎牛血清、1% PS的DMEM/F12培養基培養，取材24 h后全量換液，此后每隔3 d，半量換液1次，細胞培養10～14 d左右，可觀察到細胞長滿瓶底，并出現分層現象：底層細胞充分鋪展，接觸緊密，多為扁平、具有多個突起的大細胞(星形膠質細胞)，而上層細胞多類圓形、折光性強，邊緣有毛刺樣突起，附于星形膠質細胞表面生長(以小膠質細胞為主)。參考McCarthy等[6]經典分離膠質細胞的方法，手搖培養瓶3～5 min，使附于星形膠質細胞表面的細胞脫落下來，棄去培養液，即可去除小膠質細胞及其他雜細胞。

2.2原代星形膠質細胞的鑒定以5×107·L-1的密度接種于用多聚賴氨酸包被的24孔板中，24 h后吸去上清液，并用PBS浸洗3遍，而后使用預冷的4%多聚甲醛固定20 min，用PBS洗3次，每次3 min，滴加5%的BSA室溫封閉30 min后，用PBS洗3次，加入稀釋的一抗(GFAP單克隆抗體1 ∶500)，放于濕盒中孵育過夜；次日，使用PBS洗3次后，滴加適量熒光二抗(1 ∶500)，避光室溫孵育2 h，PBS洗3次后，滴加DAPI染料室溫染核8 min后，使用PBS洗2次，滴加抗熒光淬滅封片液封片，使用熒光顯微鏡觀察。

2.3實驗分組及造模、給藥待星形膠質細胞分化成熟后，將其分為正常組、正常給藥對照組、模型組、給藥組，以3×108·L-1的密度接種于用多聚賴氨酸包被的6孔板中，次日，采用含0%胎牛血清、1% PS的DMEM/F12培養基進行細胞饑餓4 h后，使用含1%胎牛血清、1% PS的DMEM/F12培養基配制的LPS(100 μg·L-1)造模24 h，并給予大黃素(10 μmol·L-1)。

2.4檢測細胞上清液NO釋放量將細胞上清液適當渦旋后，每組樣品吸取100 μL，按照說明書步驟依次加入試劑一、試劑二混勻，37 ℃水浴60 min，而后加入試劑三、試劑四充分渦旋混勻30 s，室溫靜置10 min，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液加入顯色劑后混勻，室溫靜置10 min，使用酶標儀在550 nm處測各樣品吸光度值。而后根據公式計算出各樣品的NO釋放量，計算公式：NO含量/μmol·L-1=(測定OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度×樣品測試前稀釋倍數。

2.5實時熒光定量PCR檢測星形膠質細胞CD14、C3mRNA表達按照Qiagen RNeasy? Mini Kit試劑盒，提取總RNA，測定RNA的純度及濃度，以A260/A280值達到1.8～2.0為合格，表明無RNA或蛋白質污染。依照試劑盒說明書，使用RT逆轉錄試劑盒,將RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，通過熒光定量PCR技術擴增，檢測CD14、C3的表達。PCR引物由上海鉑尚生物技術有限公司合成，大鼠CD14的上游引物：5′-TGGGCAACAACG GATACCTG-3′，下游引物：5′-GAACTTGGAGGGTCG GGAAT-3′；C3的上游引物：5′-AAAATGGAATCTCT ACGAAGGTCA-3′，下游引物：5′-AGTCGCAGGTCA ATGAAGAAGTC-3′。以GAPDH為內參，校正每個樣品的Ct值(每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數)，以2-△△Ct法對基因表達進行定量分析。

2.6Westernblot法檢測星形膠質細胞C3、Egr-4蛋白表達用含1% PMSF的細胞裂解液提取總蛋白，SDS-PAGE電泳，轉膜，用封閉液封閉2 h后，加入稀釋的一抗(C3單克隆抗體1 ∶500，Egr-4單克隆抗體1 ∶100)，4 ℃孵育過夜，次日用TBST洗3遍，每遍10 min，加入1 ∶3 000稀釋HRP標記的二抗，室溫下孵育2 h后，TBST洗3遍，每遍10 min，而后加入ECL顯色劑，經凝膠成像分析系統檢測，以β-actin為內參，用目標蛋白與β-actin的灰度值比值進行各組之間的差異統計。

3 結果

3.1原代星形膠質細胞的免疫熒光鑒定GFAP是星形膠質細胞的標記物，故采用熒光標記GFAP對原代星形膠質細胞進行鑒定。由Fig 1可見，所分離的星形膠質細胞生長狀態良好，呈星狀，從胞體發出許多長而分支的突起。通過GFAP/DAPI的百分比計算可得，星形膠質細胞的純度達97%。

Fig 1 Immunofluorescence identification using

3.2大黃素對星形膠質細胞NO釋放量的影響為確保LPS模型建立成功，采用NO試劑盒檢測星形膠質細胞上清液中NO的釋放量。Fig 2結果表明，經LPS誘導24 h后，星形膠質細胞NO釋放量增加；大黃素給藥后，NO釋放量降低，且差異具有顯著性(P<0.01)。表明LPS誘導的炎癥模型建立成功，大黃素顯示出明顯的抗炎作用。

Fig 2 Effect of emodin on NO content of astrocytes

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsLPS

3.3大黃素對星形膠質細胞CD14、C3mRNA表達的影響Fig 3結果表明，經LPS誘導的星形膠質細胞CD14、C3 mRNA表達量升高，大黃素干預后，CD14、C3 mRNA表達量降低，且差異具有顯著性(P<0.01或P<0.05)。

Fig 3 Effect of emodin on CD14(A)and C3 (B)mRNA

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsLPS

3.4大黃素對星形膠質細胞C3蛋白表達的影響Fig 4結果表明，經LPS誘導的星形膠質細胞C3蛋白表達量升高，大黃素干預后，C3 蛋白表達量降低，且差異具有顯著性(P<0.05)。表明經LPS誘導后，星形膠質細胞由靜息轉化為反應性星形膠質細胞，表達C3這一指標蛋白。

3.5大黃素對星形膠質細胞Egr-4蛋白表達的影響Fig 5結果表明，經LPS誘導的星形膠質細胞Egr-4蛋白表達量升高，大黃素干預后，Egr-4蛋白表達量降低，且差異具有顯著性(P<0.01)。

4 討論

內毒素作為革蘭陰性桿菌細胞壁外層的結構成分，是一種廣泛存在于自然界中的致病原，其主要的致病成分為LPS。CD14在介導跨膜信號轉導過程中承擔識別LPS的作用[7]，是LPS的受體。

Fig 4 Effect of emodin on C3 protein expression

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsLPS

Fig 5 Effect of emodin on Egr-4 protein expression

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsLPS

LPS結合于細胞后，通過LPS-脂多糖結合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)-CD14三聯復合物作用于Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)，激活NF-κB和MAPKs信號通路，誘導細胞釋放大量細胞因子和炎性介質，如NO、IL-6、TNF-α等[8-9]，導致炎癥的發生或進一步加重。本實驗研究發現，經LPS誘導后，星形膠質細胞大量釋放NO，CD14 mRNA表達量明顯上調，而經大黃素干預后，NO釋放量減少，CD14 mRNA表達量明顯下降。說明大黃素對LPS誘導的星形膠質細胞有較好的抗炎作用，其抗炎機制可能與下調CD14表達，阻斷內毒素信號轉導通路有關。

補體系統通過直接溶解細胞、細菌及病毒，發揮調理作用及引起機體炎癥反應參與宿主早期抗感染免疫；通過清除免疫復合物及凋亡細胞，同時與凝血、纖溶及激肽系統等相互作用，維持機體穩態[10]。激活補體系統的途徑主要有經典途徑、旁路途經和凝集素途徑，而C3是這三大途徑的樞紐分子，是補體系統的核心，C3的活化是放大補體級聯反應的關鍵步驟，在不同條件下激活三大途徑后形成C3轉化酶，裂解C3分子形成C3a和C3b，從而產生炎癥[11]。本實驗結果顯示，星形膠質細胞C3的mRNA和蛋白表達量在LPS誘導后明顯增加，而經大黃素干預后，C3表達量明顯下調，說明大黃素的作用機制可能與調控以C3為核心的補體系統有關。

Egrs為早期生長反應因子，包括Egr-1、Egr-2、Egr-3、Egr-4，與神經系統聯系密切。該基因家族成員在C端均有1個由3個鋅指單位構成的DNA結合區域，這也是Egr基因家族在功能上具有相似性的原因，而其中Egr-4與Egr-1的氨基酸序列更是達到了83%的同源性，功能最為相似。目前已有報道，Egr-4結合NFAT或NF-κB可以增強下游炎癥因子的轉錄[12-13]。另一方面，在大腦中動脈閉塞模型大鼠中，上調Egr-4的表達有減輕炎癥，保護神經細胞的作用[14]，提示Egr-4具有雙向調節功能。總的來說，針對Egr-4生物學功能及其對下游基因的轉錄調控研究尚少，但大量研究發現，與Egr-4高度同源的Egr-1在各類炎癥相關性疾病的發生、發展中有直接或間接的參與，不但使細胞從靜息期進入增殖期，調節細胞生長與分化，還通過各類細胞因子，如細胞間黏附分子1、血管細胞間黏附分子1、IL-1β、TNF-α等，誘發炎性蛋白的表達，啟動炎癥的發生[15]。本實驗結果表明，星形膠質細胞在LPS誘導后Egr-4蛋白表達升高，因此，我們猜測Egr-4在LPS誘導星形膠質細胞這一模型中，與Egr-1相似，在炎癥反應中表達上調，具有促炎作用，可能通過與LPS-LBP-CD14三聯復合物作用于TLR4后所激活的NF-κB結合，調控下游炎性因子的轉錄，參與炎癥的發生與發展，而大黃素通過下調Egr-4的表達，抑制轉錄過程，從而發揮抗炎作用。同時，有文獻報道，C3與Egr-4存在一定的上下游間的聯系[14]，但在此模型中有待進一步研究。

綜上所述，大黃素對LPS誘導星形膠質細胞炎癥反應的保護作用可能與阻斷內毒素信號轉導通路，調控C3與Egr-4，從而減輕炎癥有關。