氟西汀抑制慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠海馬胃泌素釋放肽受體表達(dá)增高

陳建新，陳 悅，姚麗華，王高華，王曉萍，劉忠純

(1. 湖北大學(xué)教育學(xué)院心理學(xué)系，湖北 武漢 430062；2. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院精神衛(wèi)生中心，湖北 武漢 430060)

近來，許多研究表明胃泌素釋放肽(gastrin-releasing peptide, GRP)/胃泌素釋放肽受體(gastrin-releasing peptide receptor, GRPR)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病中起著重要的作用[1]。GRP是一種神經(jīng)肽，GRPR作為GRP的受體，通過結(jié)合GRP而發(fā)揮作用，GRPR在多種哺乳動物腦內(nèi)(包括人類和大、小鼠)大量表達(dá)，并且在多種哺乳動物組織和細(xì)胞中有著相似的生物學(xué)機(jī)制[2]。研究表明，在應(yīng)激條件下，實驗動物腦內(nèi)GRPR的表達(dá)明顯上調(diào)，GRPR激動劑(GRP)可誘發(fā)應(yīng)激樣行為學(xué)改變，而GRPR拮抗劑(RC-3095)可以逆轉(zhuǎn)上述行為學(xué)改變[3]。上述研究表明，GRPR與應(yīng)激引起的神經(jīng)精神疾病(包括抑郁癥)相關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步提示GRP/GRPR通路可能成為神經(jīng)精神疾病(包括抑郁癥)新的治療靶點[4]。

氟西汀(fluoxetine，F(xiàn)LX)是一種選擇性5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)再攝取抑制劑，是臨床最常見的一線抗抑郁藥。研究發(fā)現(xiàn)，氟西汀使用后可以立即升高突觸間隙的5-HT濃度，然而，其抗抑郁的臨床療效卻需要數(shù)周才能顯現(xiàn)，這種不一致顯示，除了單胺能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)以外，可能還有其他機(jī)制涉及氟西汀的臨床抗抑郁活動[5]。

海馬作為應(yīng)激抑郁的重要腦區(qū)，國內(nèi)外的研究表明，海馬與抑郁癥的發(fā)病和治療有著重要的關(guān)聯(lián)[6]。研究表明，GRPR在海馬(特別是CA3區(qū)和齒狀回)有廣泛的分布，并參與了海馬有關(guān)記憶的調(diào)節(jié)作用[7]。然而，目前尚無關(guān)于海馬GRPR的表達(dá)與抑郁癥發(fā)病和抗抑郁治療機(jī)制的相關(guān)研究報道。因此，通過可靠的應(yīng)激抑郁動物模型，進(jìn)一步探討海馬GRPR的表達(dá)與氟西汀抗抑郁作用的關(guān)系是必要的。本研究擬在制備慢性不可預(yù)見性應(yīng)激(chronic unpredictable stress, CUS)C57BL/6小鼠應(yīng)激抑郁模型的基礎(chǔ)上，研究氟西汀對CUS小鼠海馬GRPR表達(dá)的影響。進(jìn)一步探討氟西汀抗抑郁作用的新機(jī)制，為抑郁癥的發(fā)生和治療的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物30只♂C57BL/6小鼠，SPF級，6～8周齡，體質(zhì)量(19±2)g，由武漢大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證編號：4200593324。所有小鼠正常飼養(yǎng)于籠中，自由進(jìn)食和飲水。1周后，利用隨機(jī)數(shù)字表將小鼠隨機(jī)分為3組：實驗對照組、CUS模型組、氟西汀處理組，每組實驗動物10只。

1.2藥品與試劑氟西汀原藥(上海金洹化工科技有限公司)；兔多克隆抗體GRPR(MC-830, 日本MBL)；兔多克隆抗體GAPDH(ab9485,美國Abcam公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(sc-2004, 美國Santa Cruz公司)。

1.3儀器EthoVision 3.0動物行為自動跟蹤系統(tǒng)(荷蘭Noldus公司)；奧林巴斯BX50顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；JEDA801D計算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)(捷達(dá)科技有限公司)；凝膠掃描分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.4方法

1.4.1 CUS模型的建立 基于前期的研究，進(jìn)行適當(dāng)修改，建立抑郁動物模型[8]。對小鼠采用10種不同的應(yīng)激刺激：4 ℃冰水游泳5 min，潮濕墊料24 h，鼠籠45°傾斜24 h，夾尾1 min，行為限制2 h，24 h晝夜顛倒，42 ℃熱水游泳5 min，禁水24 h，禁食24 h，鼠籠搖晃15 min。對同一只小鼠不連續(xù)使用同樣的刺激，每天刺激2次，連續(xù)35 d。對照組小鼠不進(jìn)行任何處理。

1.4.2 糖水偏好實驗 實驗前，對小鼠進(jìn)行糖水適應(yīng)性訓(xùn)練。隨后禁水12 h(20 ∶00-8 ∶00)，糖水偏好實驗在每天上午8 ∶00-9 ∶00進(jìn)行。給予小鼠事先稱量好的兩瓶水，一瓶質(zhì)量濃度為10 g·L-1蔗糖水，一瓶為動物日常飲用水。1 h后，計算小鼠的糖水偏好：糖水偏好=糖水飲用量/總液體飲用量。

1.4.3 曠場實驗 曠場大小為80 cm×80 cm×40 cm，實驗從早上9 ∶00開始，將小鼠放置于曠場中心，使用動物行為自動跟蹤系統(tǒng)進(jìn)行記錄，并分析小鼠在曠場內(nèi)10 min的行為活動，主要觀測的曠場行為學(xué)指標(biāo)包括直立次數(shù)(垂直運動得分記錄為兩前爪騰空或攀附墻壁)、總行程、平均移動速度。每只小鼠均單獨進(jìn)行測試，兩只小鼠實驗之間，將曠場清理干凈[8]。

1.4.4 氟西汀治療 實驗前，將氟西汀溶解在生理鹽水中。向小鼠腹腔注射氟西汀(10 mg·kg-1)[8]或等體積的生理鹽水，連續(xù)使用21 d。

1.4.5 免疫印跡分析 取出小鼠的海馬組織，勻漿離心，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。分別加入GRPR抗體(1 ∶200)及內(nèi)標(biāo)GAPDH抗體(1 ∶300)，輕搖孵育過夜。洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1 ∶5 000),室溫輕搖1 h。充分洗膜后加ECL，膠片曝光顯影。用凝膠掃描分析系統(tǒng)對膠片進(jìn)行灰度分析。GRPR表達(dá)的相對含量變化用GRPR與GAPDH條帶的灰度值的比值表示。

1.4.6 熒光定量PCR檢測 取出小鼠的海馬組織，用TRIzol法提取總RNA后，以其為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用熒光定量PCR檢測GRPR mRNA的表達(dá)。GRPR的上游引物序列：5′-AGCTGACAGGTACAAAGCCATT-3′，下游引物序列：5′-AGGGTGTAGCTCATTGGAGTGT-3′；內(nèi)參β-actin的上游引物序列：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物序列：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′。反應(yīng)體系：2×SYBR-Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，雙蒸水7 μL。PCR反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min 1個循環(huán)，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣本均重復(fù)3個復(fù)孔，取平均值為最終結(jié)果，目的基因與內(nèi)參基因同時進(jìn)行反應(yīng)。所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法計算。

2 結(jié)果

2.1氟西汀對CUS小鼠行為學(xué)指標(biāo)的影響

2.1.1 氟西汀治療1周后對行為學(xué)指標(biāo)的影響 由Tab 1可見，氟西汀組小鼠糖水偏好、曠場行為學(xué)指標(biāo)(總行程、平均移動速度和直立次數(shù))與對照組比較明顯減少(P<0.01)；其行為學(xué)指標(biāo)與CUS組相比，差異無顯著性(P>0.05)。說明經(jīng)過1周的氟西汀干預(yù)，小鼠行為學(xué)指標(biāo)無明顯改善。

2.1.2 氟西汀治療2周后對行為學(xué)指標(biāo)的影響 由Tab 2可見，氟西汀組小鼠糖水偏好、曠場行為學(xué)指標(biāo)(總行程、平均移動速度和直立次數(shù))與對照組比較，仍明顯減少(P<0.01)；其行為學(xué)指標(biāo)與CUS組相比有明顯改善(P<0.01)。說明經(jīng)過2周的氟西汀干預(yù)，小鼠行為學(xué)指標(biāo)有一定的改善。

2.1.3 氟西汀治療3周對行為學(xué)指標(biāo)的影響 由Tab 3可見，氟西汀組小鼠糖水偏好、曠場行為學(xué)指標(biāo)(總行程、平均移動速度和直立次數(shù))與CUS組比較明顯增加(P<0.01)；其行為學(xué)指標(biāo)與對照組相比，差異無顯著性(P>0.05)。說明經(jīng)過3周的氟西汀干預(yù)，小鼠行為學(xué)指標(biāo)已經(jīng)恢復(fù)到正常水平。

2.2氟西汀對CUS小鼠海馬GRPR表達(dá)的影響Fig 1的熒光定量PCR及Fig 2的免疫印跡結(jié)果顯示，CUS組小鼠海馬GRPR mRNA及蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.01)，氟西汀明顯降低GRPR mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.01)。

Fig 1 GRPR mRNA expression in C57BL/6mouse hippocamus as revealed by

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsCUS

Tab 1 Comparison of sucrose preference and open fieldtests in control group, CUS group and FLX group mice(FLX for one week)

**P<0.01vscontrol

Tab 2 Comparison of sucrose preference and openfield tests in control group, CUS group and FLX group mice(FLX for two weeks)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsCUS

Tab 3 Comparison of sucrose preference and openfield tests in control group, CUS group and FLX group mice(FLX for three weeks)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsCUS

Fig 2 GRPR expression in C57BL/6 mousehippocamus as revealed by Western

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsCUS

3 討論

抑郁癥是目前臨床上最常見的，慢性反復(fù)發(fā)作的重性精神疾病，其人群發(fā)病率有逐漸增高的趨勢。目前，人們已經(jīng)逐漸認(rèn)識到，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)學(xué)說單獨不足以解釋抑郁癥的發(fā)病及抗抑郁藥的作用機(jī)制[9]。因此，探索抑郁癥新的發(fā)病機(jī)制和可靠的藥物作用靶點，成為當(dāng)前抑郁癥研究的重點和熱點。越來越多的研究表明，GRP/GRPR通路可能在抑郁癥的發(fā)病和治療中起著重要作用[4]。

GRPR屬于一類G蛋白偶聯(lián)受體，其位于細(xì)胞膜上，整個分子由7個疏水跨膜區(qū)構(gòu)成，GRPR由384個氨基酸構(gòu)成[10]。當(dāng)GRP結(jié)合GRPR后，激活G蛋白，隨后啟動整個細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，包括一系列的蛋白激酶信號級聯(lián)反應(yīng)，如促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)/胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)等信號通路[10]。來自臨床神經(jīng)精神疾病的病人和實驗動物的研究顯示，GRP和GRPR的表達(dá)水平在疾病狀況下發(fā)生改變。Gerner等[11]報道，精神分裂癥患者的腦脊液中GRP表達(dá)水平明顯降低。GRP和GRPR的解剖學(xué)分布，與其在情感和應(yīng)激相關(guān)障礙中的作用一致。Merali等[12]研究表明，自殺死亡的抑郁癥患者腦內(nèi)表現(xiàn)出GRP的紊亂。另外，實驗動物研究顯示，應(yīng)激后，實驗大鼠表現(xiàn)出持續(xù)GRP和GRPR升高等神經(jīng)內(nèi)分泌和行為學(xué)改變[3]。而通過腦室注射或者腦內(nèi)注射系統(tǒng)給予GRPR激動劑后，可以產(chǎn)生類似于應(yīng)激樣的內(nèi)分泌和行為學(xué)改變，其中最常見的是“理毛行為”，又稱“修飾行為”，是鼠類應(yīng)激狀態(tài)時常見的表現(xiàn)[13]。

在本研究中，通過連續(xù)3周的氟西汀干預(yù)發(fā)現(xiàn)，CUS應(yīng)激小鼠雖然在干預(yù)的第1周行為學(xué)改變不明顯，但是從第2周末開始，其行為學(xué)開始有明顯的好轉(zhuǎn)，特別是在第3周末，CUS應(yīng)激小鼠的行為學(xué)已經(jīng)完全恢復(fù)，與正常組沒有差異。更重要的是，這些行為上的改變同時伴有海馬GRPR表達(dá)的變化。在本實驗中，應(yīng)激小鼠海馬的GRPR mRNA及蛋白表達(dá)明顯上升，經(jīng)過氟西汀治療3周后，GRPR mRNA和蛋白的表達(dá)恢復(fù)到與正常對照組無明顯差異。我們前期的研究顯示，經(jīng)過CUS聯(lián)合孤養(yǎng)的應(yīng)激刺激后，C57BL/6小鼠下丘腦GRPR mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高，而經(jīng)氟西汀干預(yù)后，GRPR的表達(dá)可以恢復(fù)到正常水平。小鼠下丘腦GRPR表達(dá)的這種動態(tài)變化與其行為學(xué)變化是一致的[14]。本研究結(jié)果與我們前期的研究具有一致性。結(jié)合以上研究，本研究結(jié)果進(jìn)一步提供了GRPR在氟西汀抗抑郁治療靶標(biāo)中的潛在價值。然而，關(guān)于GRPR在氟西汀抗抑郁中的精確機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，特別是其中涉及到的第二信使系統(tǒng)還不明確。研究表明，氟西汀抗抑郁活動主要與G蛋白啟動的cAMP蛋白激酶信號系統(tǒng)有關(guān)[15]，而GRPR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程也涉及到G蛋白有關(guān)的蛋白激酶系統(tǒng)，這兩者之間細(xì)胞內(nèi)分子的交集可能為解釋GRPR參與氟西汀的抗抑郁活動精確機(jī)制，甚至為闡明臨床抗抑郁活動的延遲效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)制提供了方向。