四嗪二甲酰胺抑制胰腺癌細胞AsPC-1增殖及其機制研究

陳素峰，呂亞萍，夏 駿，徐 柯，周永列

(1. 浙江省人民醫院檢驗中心，浙江 杭州 310014；2. 杭州醫學院附屬人民醫院檢驗中心，浙江 杭州 310053；3. 浙江工業大學藥學院，浙江 杭州 310014)

胰腺癌是惡性程度極高的消化道惡性腫瘤，在美國占癌癥死亡的第4位，其年發病率約為1/10 000[1]，在中國，2015年胰腺癌的發病率上升至第6位，死亡率上升至第9位。胰腺癌具有診斷較晚、局部侵襲力高、早期廣泛轉移、病死率極高、預后極差、長期生存率極低等特點，5年生存率<5%，有“癌中之王”之稱[2]。

四嗪是一類四氮雜苯化合物，具有良好的生物活性，目前作為藥品上市的替莫唑胺(temozolomide)就是一種咪唑四嗪類口服抗腫瘤藥物，對白血病、淋巴瘤及實體腫瘤都有較好的療效。本研究使用的四嗪二甲酰胺(ZGDHu-1)是根據藥物構效學設計并合成的一種具有原創性和自主知識產權的，并經體外抗腫瘤活性篩選的新四嗪類化合物[3-4]。目前尚未有研究表明ZGDHu-1在胰腺癌AsPC-1細胞中的抗腫瘤效應。為此，本文觀察了ZGDHu-1對胰腺癌細胞AsPC-1的增殖抑制、誘導凋亡及細胞周期阻滯的作用，并探討其主要作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 細胞株 人胰腺癌細胞株AsPC-1購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2 試劑 ZGDHu-1由浙江工業大學藥學院制藥工程研究所提供，以乙醛、乙醇和水合肼為原料，合成中間體3，6-二甲基-1，6二氫-1，2，4，5-四嗪，并以此為先導化合物，經藥物分子設計，合成一類全新結構的S-四嗪類化合物：3，6-二取代基-1，4二氫-1，2，4，5-四嗪二甲酰胺，其相對分子質量為398，結構式見Fig 1。ZGDHu-1儲存液(10 g·L-1)用二甲基亞砜(DMSO)溶解，應用液用含10%胎牛血清的DMEM配制。DMSO、MTT、Hoechst 33258試劑，均購自美國Sigma公司；瑞氏染液購自珠海貝索公司；Annexin V/PI試劑盒購自美國Invitrogen公司；DNA分析試劑盒(DNA Prep Kit)購自美國Beckman Coulter公司；蛋白提取試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒購自北京鼎國生物有限公司；一抗caspase-3(8G10) 、Bax、β-actin，購自美國Cell Signaling公司。

Fig 1 Chemical structure of ZGDHu-1

1.1.3 儀器 細胞培養箱(Heal Force公司)；熒光顯微鏡(尼康公司)；酶標儀(Bio-Rad公司)；流式細胞儀(Beckman Coulter公司)。

1.2方法

1.2.1 細胞培養 細胞株培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，含100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素，置37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養。每2～3 d以1 ∶3～1 ∶5傳代。

1.2.2 胰腺癌細胞的生長抑制實驗 采用MTT法檢測胰腺癌細胞的增殖情況。取對數生長期的AsPC-1細胞，調整細胞密度至4×107·L-1，接種于96孔板中，每孔200 μL，置37 ℃培養16～24 h(過夜)。加入ZGDHu-1(0、0.025、0.125、0.25、0.5、1.25、2.5、12.5 μmol·L-1)，每個濃度設6個復孔，同時設空白對照和陰性對照，置37 ℃、5% CO2培養箱中分別培養24、48、72 h后，吸棄孔內培養上清液，每孔分別加入濃度為5 g·L-1的MTT 20 μL和新鮮DMEM高糖培養基200 μL，繼續培養4 h，吸棄上清液，向每孔中加入150 μL DMSO，震蕩10 min至結晶全部溶解，酶標儀490 nm波長處讀取各孔的光吸收值(OD值)。按如下公式計算ZGDHu-1對細胞增殖的影響：細胞增殖率=[(OD實驗-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100%。

1.2.3 細胞形態觀察 采用瑞氏染色和Hoechst 33258熒光染色觀察細胞形態變化。預先在6孔板中加入無菌蓋玻片，以每孔5×105個細胞接種于6孔板中，37 ℃培養過夜。按濃度梯度加入ZGDHu-1培養24、48 h。用于Hoechst 33258觀察的細胞用固定液(甲醇 ∶冰醋酸=3 ∶1)4 ℃固定5 min，PBS沖洗后，用Hoechst 33258(5 mg·L-1)染色15 min，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態及凋亡小體。用于瑞氏染色觀察的細胞，加瑞氏染液A液和B液，混勻后染色10 min，在普通光學顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.4 Annexin V/PI檢測細胞早期凋亡情況 取對數生長期的細胞，以每孔5×105個細胞接種于6孔板中，37 ℃培養過夜。按梯度濃度加入ZGDHu-1培養24、48 h后，收集孔內培養上清液中和0.25%胰酶消化的單層細胞，用預冷的PBS溶液洗滌1遍。向洗滌好的細胞中加入100 μL 1×結合緩沖液，重懸成單個細胞后，加入5 μL的Annexin V試劑和1 μL的PI工作試劑(100 mg·L-1)，室溫避光孵育15 min，加入400 μL 1×的結合緩沖液輕輕混勻，使用流式細胞儀分析。以Annexin V的熒光強度為橫坐標，以PI熒光強度為縱坐標，繪制散點圖，記錄Annexin V單陽性區的細胞占所有分析細胞的百分比。

1.2.5 流式細胞術分析AsPC-1細胞周期 收集處理后的AsPC-1細胞，加入DNA-Prepkit透膜液(內含Triton和RNase)50 μL，放置1 min，加PI染液250 μL，作用5 min，流式細胞儀檢測分析：以PI熒光強度為橫坐標，以細胞數量為縱坐標，繪制曲線圖，調整G0/1期、S期和G2/M期細胞位置，排除黏連細胞后，計數至少10 000個細胞，分析細胞周期及DNA表達情況。使用Wincycle32-Shortcut軟件分析，并計算胰腺癌細胞亞二倍體峰、G0/1期、S期和G2/M期的百分率。

1.2.6 Western blot法分析細胞相關蛋白表達變化 取對數生長期的細胞，以2.5×106個/皿的密度接種于75 cm2平皿中，37 ℃培養過夜后，以梯度濃度的ZGDHu-1作用24、48 h，采用 Western blot 檢測相關蛋白表達水平，β-actin為內參蛋白，步驟如下：收集處理后的細胞，PBS洗1遍，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，4 ℃、14 000 r·min-1離心15 min后，取上清，用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，上樣蛋白總量為每孔50 μg，電泳結束后，將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉移到PVDF膜上，10%脫脂奶粉中封閉2 h，一抗Bax、caspase-3或β-actin(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加二抗(1 ∶10 000)室溫孵育1 h，然后用ECL發光，X線膠片曝光成像，ImageJ軟件進行圖像分析。

2 結果

2.1ZGDHu-1抑制胰腺癌細胞的增殖Fig 2的MTT結果顯示，胰腺癌細胞株AsPC-1經梯度濃度ZGDHu-1分別孵育24、48、72 h后，ZGDHu-1能明顯抑制AsPC-1細胞的增殖，且呈濃度-時間依賴效應。

Fig 2 Viability rate of AsPC-1 cells after treatment with different concentrations of ZGDHu-1 determined by n=3)

*P<0.05vscontrol

通過濃度效應曲線計算后顯示，ZGDHu-1作用AsPC-1細胞48 h的IC50為3 μmol·L-1，而由于AsPC-1細胞對高于1.25 μmol·L-1的ZGDHu-1幾乎進入平臺期，下列實驗設置的ZGDHu-1濃度為0、0.25、0.5、1.25 μmol·L-1。

2.2ZGDHu-1誘導胰腺癌細胞凋亡

2.2.1 ZGDHu-1作用胰腺癌細胞后的形態學變化 Fig 3瑞氏染色結果顯示，與對照組相比，實驗組的胰腺癌細胞間連接消失，核質深染，細胞體積縮小，細胞核固縮、碎裂；細胞膜皺縮內陷，細胞內形成數個大小不等的凋亡小體。且隨著ZGDHu-1濃度的增加，凋亡細胞和凋亡小體比例明顯增多。

Fig 4的Hoechst 33258熒光染色的結果顯示，對照組的胰腺癌細胞大小一致，細胞核呈彌散均勻的藍色熒光；ZGDHu-1作用后的胰腺癌細胞大小不一，細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒塊狀熒光，在細胞內能明顯觀察到高藍色熒光強度的凋亡小體。

2.2.2 ZGDHu-1誘導胰腺癌細胞的早期凋亡 Fig 5的Annexin V/PI染色結果顯示，AsPC-1細胞與不同濃度的ZGDHu-1(0、0.25、0.5、1.25 μmol·L-1)作用48 h后，早期凋亡的AsPC-1細胞比率(Annexin V+/PI-)分別為(0.4±0.3)%、(1.6±0.2)%、(12.0±2.3)%、(20.6±3.6)%。研究結果表明，隨著ZGDHu-1濃度增高，細胞早期凋亡比例逐漸增高(P<0.05)，提示ZGDHu-1能誘導胰腺癌細胞凋亡，且呈濃度依賴效應。

Fig 3 AsPC-1 cells dyed with Wright’s staining and observed under a light microscope after cultured with various concentrations of ZGDHu-1 (×1 000)

Fig 4 AsPC-1 cells dyed with Hoechst 33258 staining and observed under a fluorescence microscope after cultured with various concentrations of ZGDHu-1 (×400)

2.3ZGDHu-1阻滯胰腺癌細胞AsPC-1于G2/M期為了檢測細胞周期改變是否參與ZGDHu-1誘導細胞凋亡的過程，采用流式細胞術分析胰腺癌細胞周期分布變化。Fig 6和Tab 1結果表明，AsPC-1細胞與不同濃度的ZGDHu-1共同培養24、48 h后，胰腺癌細胞被明顯阻滯于G2/M期，且隨著ZGDHu-1濃度的增高，阻滯于G2/M期的胰腺癌細胞比例也逐漸增加，當ZGDHu-1濃度達到1.25 μmol·L-1時，處于G2/M期的AsPC-1細胞達到(69.6±0.4)%(P<0.05)。

Fig 5 Apoptosis of AsPC-1 cells treatment with ZGDHu-1 for 48 h n=3)

Annexin V+/PI-represented early apoptosis and Annexin V+represented total apoptosis (include early and late apoptosis) as shown in the histogram.*P<0.05vscontrol.

Fig 6 ZGDHu-1 induced G2/M cell cycle arrest on AsPC-1 cells

CellcycleConcentration of ZGDHu-1/μmol·L-124 h00.250.51.2548 h00.250.51.25G0/G1/%67.9±2.164.3±1.4?33.7±0.2?9.8±0.3?84.6±2.366.6±0.6?44.1±1.5?9.5±0.3?S/%31.0±0.728.0±0.637.4±1.540.2±1.28.3±1.117.6±1.16.0±0.820.9±0.9G2/M/%1.1±0.47.6±0.4?28.9±1.7?50.0±1.7?7.1±0.515.8±0.5?49.9±2.2?69.6±0.4?

*P<0.05vscontrol

2.4ZGDHu-1通過激活caspase-3信號通路誘導胰腺癌AsPC-1細胞凋亡Fig 7的Western blot結果顯示，與對照組相比，ZGDHu-1作用后，Bax蛋白表達上調，尤以48 h變化更為明顯。且隨著ZGDHu-1濃度和作用時間的增加，AsPC-1細胞的caspase-3蛋白表達明顯降低。結果表明，ZGDHu-1誘導胰腺癌細胞株AsPC-1凋亡可通過上調促凋亡蛋白Bax和激活caspase-3信號通路實現。

Fig 7 AsPC-1 cells cultured with ZGDHu-1 for 24 and 48 h and expression of Bax and caspase-3 protein

*P<0.05vscontrol

3 討論

胰腺癌是先天性的耐藥腫瘤之一，腫瘤細胞對化療藥物的抵抗成為胰腺癌治療失敗的主要原因[5]。因此，設計新的能克服抗藥性和提高胰腺癌臨床轉歸的靶向治療策略迫在眉睫。

前期研究結果已證實，ZGDHu-1能在體外明顯抑制白血病細胞和肺癌細胞的增殖，而且在這些腫瘤中的促凋亡效應是獨立于其抗增殖行為[6-7]。本實驗將不同濃度的ZGDHu-1與胰腺癌細胞株AsPC-1共同培養24、48、72 h后，研究結果表明，ZGDHu-1能在體外明顯抑制胰腺癌細胞的增殖，且呈現濃度和時間的依賴效應。

觀察細胞形態變化是了解ZGDHu-1能否誘導細胞凋亡最直觀的方式。本研究中，通過瑞氏染色發現，隨著ZGDHu-1濃度的增高，胰腺癌細胞間細胞連接消失，核質深染，細胞體積縮小，細胞核固縮、邊緣化、核碎裂，細胞內形成數個大小不等的凋亡小體；經Hoechst 33258熒光染色后，顯示ZGDHu-1作用后的胰腺癌細胞大小不一，細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒塊狀熒光，在細胞內可明顯觀察到高藍色熒光強度的凋亡小體。表明ZGDHu-1作用后，胰腺癌細胞出現了明顯的凋亡，而且隨著ZGDHu-1濃度的增加，凋亡細胞和凋亡小體比例明顯增多，提示ZGDHu-1作用后，胰腺癌細胞出現了明顯的凋亡現象。

在細胞凋亡早期，細胞膜上的磷脂酰絲氨酸由膜內側外翻至細胞膜外側，Annexin V能與膜外的磷脂酰絲氨酸特異性結合，而碘化丙啶(PI)不能透過完整的細胞膜[8]，表明Annexin V陽性和PI陰性的細胞為早期凋亡細胞。通過流式細胞術檢測ZGDHu-1作用胰腺癌細胞中Annexin V和PI的熒光強度，可以判斷胰腺癌細胞是否發生早期凋亡。本實驗結果顯示，ZGDHu-1作用于AsPC-1細胞48 h后，Annexin V+/PI-比率逐漸增高，最高比例為20.6%，提示ZGDHu-1能誘導細胞早期凋亡。

迄今為止，關于ZGDHu-1誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制有了廣泛的研究。此前的研究表明，NF-κB信號通路可能在ZGDHu-1誘導髓系白血病細胞凋亡中發揮關鍵作用[9]，而另一項研究結果表明ZGDHu-1可能通過上調促凋亡蛋白的表達水平，如Bax和p53，從而抑制肺癌細胞的增殖[6]。但目前關于ZGDHu-1對胰腺癌的抗腫瘤效應和相關的分子機制尚未闡明。

細胞周期是保證細胞增殖的一個錯綜復雜的過程，其可以分為4個階段：DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)以及細胞分裂期(M期)。本研究中，通過流式細胞術分析胰腺癌細胞的細胞周期，顯示當1.25 μmol·L-1ZGDHu-1作用AsPC-1細胞48 h后，胰腺癌細胞基本停滯于G2/M期，顯示ZGDHu-1將胰腺癌細胞周期明顯阻滯于G2/M期，且呈濃度依賴關系。

目前主要研究的凋亡途徑有兩個：內源性途徑(線粒體途徑)和外源性途徑(死亡受體途徑)[10]。線粒體途徑是被無數的壓力信號激活，如DNA損傷，導致線粒體外膜通透性增加和凋亡蛋白的釋放，如細胞色素C和線粒體源性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活物由線粒體進入細胞質中。線粒體途徑中，Bcl-2能抑制細胞色素C的釋放，而Bad、Bax則能促進細胞色素C的釋放[11-13]。然而，死亡受體途徑是通過死亡配體與細胞表面受體(TNF受體超家族)結合后激活，通過一系列復雜的信號轉導過程，將凋亡信號向細胞內部傳遞，進一步激活凋亡的啟動者caspase-8和后續的執行者caspases[14]。caspase-3是一個執行者半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶，是線粒體途徑和死亡受體途徑共同通路中的下游激活者[15]。在本研究中，與對照組相比，ZGDHu-1作用后的Bax蛋白表達水平增加。此外，本研究顯示，隨著ZGDHu-1濃度和作用時間的增加，caspase-3前體的表達水平明顯下降，提示ZGDHu-1主要通過激活caspase-3，誘導體外胰腺癌細胞凋亡。

綜上所述，目前的研究表明，ZGDHu-1抑制胰腺癌細胞增殖的作用主要通過誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期于G2/M期來實現。ZGDHu-1誘導細胞凋亡的分子機制主要通過促凋亡蛋白Bax的上調及caspase-3的活化。后期，我們也會探索更多ZGDHu-1抑制胰腺癌增殖的分子機制。

(致謝：本實驗在浙江省人民醫院檢驗中心完成，感謝各位老師和同學對實驗的指導與幫助！)