柯里拉京對人惡性黑色素瘤細胞抑制作用機制的研究

黃海潮，周 捷，鄭公銘，徐單單，臧林泉，聶 陽

(1. 廣東食品藥品職業學院實驗實訓中心，廣東 廣州 510520；2. 中山大學腫瘤防治中心藥學部，廣東 廣州 510060；3. 廣東藥科大學藥學院，廣東 廣州 510006)

惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM) 是源于上皮黑色素細胞的惡性腫瘤，是皮膚腫瘤中惡性程度最高的瘤種，其具有發病隱蔽、轉移率高、放化療敏感性低的特點，因而常導致患者預后不佳、死亡率高。目前，我國黑色素瘤發病率較低，但其危害性以及總體死亡率卻逐年上升[1]。研究表明，黑色素瘤細胞對放療的敏感性低，原因是其產生的黑色素可削弱射線的殺傷作用。目前，隨著人們對黑色素瘤發病機制研究的不斷深入，一系列療效明顯的新藥逐漸研發面世，包括重組人源抗 PD-1單抗 Nivolumab，抗 CTLA-4 單克隆抗體Ipilimumab，BRAF V600E 突變抑制劑Vemurafinib、Dabrafenib 等免疫靶向藥物[2]。盡管這些藥物在臨床試驗中均取得滿意的療效，然而該類藥物價格高昂，國內市場流通量少，毒副作用仍未明確，尚難普及使用，未能惠澤日益增多的患者。因此，通過中醫藥尋找安全低毒、有效經濟的活性物質，是目前我國藥物研究的熱點。

柯里拉京(corilagin，Cor)是一種逆沒食子酸鞣質，為酚類化合物，在植物中廣泛分布。Cor是有多種藥理活性的天然產物，具有抗氧化、抗炎、保護肝臟等活性，在抗腫瘤方面，可明顯抑制卵巢癌、人肝癌、喉癌等癌細胞的體外生長[3]。基于其抗腫瘤方面的作用，課題組開展了研究龍眼果核的植物多酚成分，發現龍眼果核中富含Cor[4]；并對其中的多個物質進行活性研究，發現Cor對黑色素瘤細胞具有明顯的抑制作用[5]，但其對細胞蛋白表達以及相關信號通路的影響均未見深入研究。本項目以人源性的MM細胞A375為病理模型，研究Cor對細胞活性、凋亡通路蛋白的表達以及黑色素生成的影響，初步探討Cor對黑色素瘤產生抑制作用的機制。

1 材料與方法

1.1細胞人MM細胞株A375，由中山大學實驗動物中心提供。

1.2藥物與試劑Cor(自制，經測定其含量達99.1%)；Hoechst 33258、酪氨酸酶(tyrosinase)活性比色法定量檢測試劑盒，美國Sigma Aldrich公司；CCK-8試劑盒，東仁化學科技(上海)有限公司；高糖DMEM培養基、特級胎牛血清(FBS)，美國Gibco公司；AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；Bcl-2、Bax、β-actin、cleaved-caspase-3、p-Akt、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(phosphatased glycogen synthesis kinase 3β, p-GSK-3β)、周期蛋白D1(cyclin D1)等一抗以及二抗，Cell Signaling Technology 公司。

1.3儀器311型細胞培養箱、Sorvall ST 40臺式離心機(美國Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)；酶標儀(美國Bio-Tek公司)；FACSVerse流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)。

1.4細胞培養將A375細胞接種于含10% FBS、100 kU·L-1青霉素、0.1 g·L-1硫酸鏈霉素的高糖DMEM中，在37 ℃、飽和濕度、5% CO2、95%空氣的細胞培養箱中培養。待細胞生長覆蓋約至80%時，用2.5 g·L-1胰酶消化傳代，并按3×107·L-1密度接種于培養板或培養瓶內待用。

1.5細胞存活率的檢測將A375細胞接種于96 孔板中，接種12 h后，換無血清高糖DMEM培養基，12 h后分別加入終濃度為 5、10、20、40、80 μmol·L-1的Cor，并設置空白細胞對照組，各組作用24 h后，加入10 μL CCK-8，37 ℃溫育2 h后，測定各組吸光度(A值)。每組設6個復孔，所得A值按下列公式計算細胞存活率: 細胞存活率= Cor組A450值/空白細胞組A450值×100%。

1.6細胞凋亡形態的觀察將A375細胞接種于6孔板中，培養至細胞匯合度達80%～90%，根據“1.5”項實驗結果，設置Cor低、中、高(20、40、80 μmol·L-1)組以及空白細胞對照組，各組作用24 h后，用PBS小心沖洗，多聚甲醛固定后，沖洗， Hoechst 33258染色后，熒光顯微鏡觀察細胞情況。

1.7細胞凋亡率的檢測將A375細胞接種于6孔板中，按“1.6”項分組處理后，棄去培養液，PBS小心洗滌，加入2.5 g·L-1胰酶(不含EDTA)，于37 ℃消化后，用完全培養基終止消化，收集細胞懸液，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清，收集細胞后，按照試劑盒提供的步驟進行Annexin V-FITC/PI染色，流式細胞儀檢測A375細胞的凋亡率。

1.8蛋白表達量的檢測將A375細胞接種于6孔板中，按“1.6”項分組處理后，用冰冷的PBS沖洗2次，收集細胞并加入預冷細胞裂解液，4 ℃裂解30 min，12 000 r·min-1低溫離心15 min，去除細胞碎片等雜質，取上清液，BCA法測定蛋白量。用含12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，然后轉移到PVDF膜上，5% BSA封閉90 min，加入稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜后，加入二抗，37 ℃孵育1 h，再洗1遍，成像進行灰度分析，并與內參(β-actin)作比較，計算各檢測蛋白的相對表達量。

1.9酪氨酸酶活性的檢測將A375細胞接種于96孔板，待生長至近融合狀態，按“1.6”項分組處理，加入不同濃度的Cor，作用24 h后棄培養液，用pH 7.4的PBS小心洗滌2次，每孔加入1% Triton X-100溶液90 μL，迅速置-80 ℃凍存30 min，隨后室溫融化使細胞完全裂解，37 ℃預溫后，加入2.5 mmol·L-1多巴溶液100 μL，37 ℃反應0.5 h，490 nm處測定A值。酪氨酸酶活性抑制率 = (1-Cor組A490值/空白細胞組A490值)×100%。

1.10黑色素含量的測定將對數生長期A375細胞接種于24孔板，24 h后加入不同濃度的Cor。培養2 d后，胰酶消化，將細胞收集入離心管，1 000 r·min-1離心10 min，傾去上清液，再用PBS洗2次后，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液(含10% DMSO)在37 ℃作用48 h，充分裂解細胞和溶解黑色素顆粒，于405 nm處測定A值。

2 結果

2.1Cor對A375細胞的抑制作用如Fig 1所示，與對照組相比，Cor對A375細胞有明顯的抑制作用，隨著作用濃度的增加，細胞活力逐漸降低，當濃度達到10 μmol·L-1時，已開始出現明顯的抑制作用(P<0.05)，在Cor濃度為20、40、80 μmol·L-1時，抑制作用明顯逐漸增強(P<0.01)。因此，后續實驗均設此3個濃度組進一步研究分析。

Fig 1 Effect of different concentrations of Cor on viability of A375

*P<0.05,**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1)

2.2Cor誘導A375細胞凋亡形態變化通過Hoechst 33258熒光染色觀察細胞凋亡情況，亮藍色的凋亡小體的數量反映出細胞的凋亡程度。如Fig 2所示，對照組細胞的熒光較暗，著色均勻，基本不出現凋亡小體，表明細胞狀態良好；隨著Cor濃度的增加，凋亡小體數量明顯增多(圖中箭頭所示)。結果表明，Cor (20、40、80 μmol·L-1)可引起并促進黑色素瘤細胞凋亡。

Fig 2 Effect of Cor on morphology of A375 cells (×400)

A: Control; B: 20 μmol·L-1Cor; C: 40 μmol·L-1Cor; D: 80 μmol·L-1Cor. The arrows at the pictures are pointing to apoptotic body.

2.3Cor誘導A375細胞凋亡率明顯升高如Fig 3所示，細胞凋亡率為右上區與右下區細胞所占比例之和。與對照組相比，Cor組細胞凋亡數量明顯增多，細胞凋亡率隨Cor濃度增加而增加(P<0.01)。結果表明，Cor對黑色素瘤細胞的凋亡有明顯的促進作用。

Fig 3 Effect of different concentrations of Cor on apoptosis of A375 cells n=3)

A: Control; B: 20 μmol·L-1Cor; C: 40 μmol·L-1Cor; D: 80 μmol·L-1Cor; E: Apoptotic rate of different groups.**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1).

2.4Cor降低Bcl-2表達，增加Bax、cleavedcaspase-3蛋白的表達水平如Fig 4所示，Cor組的Bcl-2表達量均明顯低于對照組，而Bax、cleaved caspase-3的表達量以及 Bax/Bcl-2比值與對照組相比則明顯上升。結果表明，Cor能夠通過下調Bcl-2表達，上調Bax表達以及促進caspase-3裂解活化，促使黑色素瘤細胞凋亡。

2.5Cor降低p-Akt、p-GSK-3β、cyclinD1蛋白表達量如Fig 5所示，與對照組相比，Cor能明顯下調p-Akt、p-GSK-3β、cyclin D1的表達。

Fig 4 Effect of Cor on expression of Bax, Bcl-2, cleaved caspase-3 proteins in A375 n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1)

Fig 5 Effect of Cor on expression of p-Akt, p-GSK-3β, cyclin D1 proteins in A375 cells n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1)

2.6Cor明顯抑制A375細胞中酪氨酸酶活性酪氨酸酶是合成黑色素的關鍵酶，是黑色素瘤存在和轉移發生的標志，可作為黑色素瘤的診斷以及治療預后評價的重要指標[6]。通過檢測A375細胞中的酪氨酸酶含量的變化，判斷Cor對黑色素生成過程的影響。Tab 1結果顯示，與對照組比較，Cor組對A375細胞中酪氨酸酶活性具有明顯的抑制作用(P<0.01)，且呈濃度依賴性。

2.7Cor降低A375細胞中黑色素含量黑色素含量變化是判斷黑色素瘤發生、發展以及對放療敏感性的重要指標[7]。通過檢測給藥前后，細胞中黑色素含量變化，能有效評價Cor對黑色素生成的影響，以及對酪氨酸酶作用效果的驗證。Tab 1結果顯示，與對照組比較，Cor能有效抑制A375細胞中黑色素的生成，其作用效果隨著Cor濃度增加而增強。

Tab 1 Effect of Cor on activity of tyrosinase and content of melanin in A375

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3 討論

研究表明，黑色素瘤細胞對放療敏感性低的原因是其產生的黑色素對于射線損傷具有保護作用[8]。因此，尋找能有效抑制黑色素形成，防止黑色素瘤侵襲轉移的天然植物中的活性成分，是目前治療研究熱點。本研究中，Cor是一種具有廣泛生物活性的植物多酚，具有明顯抗腫瘤作用，并抑制腫瘤細胞遷移侵襲[9]。

本項目中CCK-8細胞活性檢測結果顯示，Cor對A375細胞有明顯的抑制作用。Hoechst 33258檢測A375細胞凋亡形態學特征表明，隨著Cor濃度的增加，凋亡細胞明顯增加。流式細胞術結果顯示，在Cor 20～80 μmol·L-1能促進A375細胞的凋亡，并根據凋亡圖像分析，隨著Cor濃度的增高，凋亡晚期的細胞明顯增多。

caspase家族是細胞凋亡的重要介質。其中caspase-3是一種在凋亡發生時頻繁啟動的死亡蛋白酶，催化許多關鍵細胞蛋白的特異性裂解，在細胞凋亡途徑的最終端效應中起著關鍵作用。活化型的caspase-3 (cleaved caspase-3)對凋亡信號起傳遞和放大作用，從而加速細胞凋亡的發展。cleaved caspase-3是惡性腫瘤不可缺少的檢查項目之一。

在細胞的線粒體凋亡途徑中，Bcl-2家族也是目前研究較多的蛋白，其在線粒體介導的凋亡途徑中起關鍵的調控作用。研究表明，Bax/Bcl-2比例的升高，能增大線粒體膜的通透性，啟動線粒體凋亡途徑，引起細胞損傷[10]。在臨床治療應用中，Bcl-2與Bax比值用于疾病的診斷和治療方案的設計；在腫瘤防治方面，可判斷及評價腫瘤藥物治療效果，是否出現耐藥性以及復發的指標之一[11]。本項目通過檢測caspase-3的活性片段cleaved caspase-3以及Bcl-2、Bax的表達，研究Cor對A375細胞凋亡信號通路的影響，并初步研究Cor對人MM作用方式以及機制。Western blot結果顯示，在Cor作用下，隨著作用濃度的增加，Bcl-2的表達逐漸下降，并且Bax表達增加，從而使Bax/Bcl-2的比例增加，引起細胞凋亡，表明Cor引起A375細胞凋亡與其影響Bcl-2以及Bax的表達相關。結果表明，在Cor作用下，cleaved caspase-3的表達明顯上升，并且其表達量隨著濃度的增加而增加，表明caspase-3裂解活化的程度增強，細胞的凋亡進程加速，細胞凋亡增加，表明Cor能影響cleaved caspase-3的表達。提示Cor可能通過Bcl-2蛋白家族介導線粒體途徑，引起A375細胞凋亡。

研究證實，Akt/GSK-3β/cyclin D1 信號通路與腫瘤細胞的存活增殖、侵襲轉移均有密切聯系[12]。MM存在著Akt信號通路的異常活化，本項目通過研究Cor對p-Akt及下游 p-GSK-3β、cyclin D1等蛋白表達的影響，觀察其抑制A375細胞的作用機制。

Cyclin D1是細胞周期蛋白中最重要的一員，其主要功能是驅動細胞由G1期進入S期。G1期是細胞在增殖過程中能接受外界信號的唯一時期，cyclin D1可激活周期蛋白依賴性激酶CDK4，推進細胞周期發展，因此相對于其他周期蛋白成員，cyclin D1可作為一個研究細胞生長狀況更為有效的指標。目前研究認為cyclin D1為原癌基因，其過度表達和基因擴增均可加快細胞周期循環，進而導致細胞增殖失控，甚至引起細胞惡化。因此，選擇檢測cyclin D1的表達量，考察Cor對A375細胞增殖的影響。研究表明，當GSK-3β被激活的Akt磷酸化后，可促進cyclin D1泛素化，使其發生降解。可見Akt/GSK-3β/cyclin D1通路調控細胞生長增殖的機制為Akt在 PI3K的作用下磷酸化生成p-Akt，繼而促使GSK-3β磷酸化生成p-GSK-3β，降低GSK-3β對cyclin D1的抑制作用，延長cyclin D1的半衰期，促使細胞增殖加快，乃至發生癌變惡化[13]。實驗結果顯示，Cor明顯降低A375細胞中p-Akt、p-GSK-3β、cyclin D1等蛋白的表達，表明Cor可通過抑制Akt的活性，加強GSK-3β對cyclin D1的抑制作用，遏制細胞周期的進展，最終產生抑制黑色素瘤的作用。此外，研究表明，Akt可以作用于Bad以及caspase-9等線粒體凋亡通路相關蛋白，抑制細胞的凋亡[14]。結合本實驗結果分析，可以推斷，Cor在抑制Akt活性的過程中，不僅參與到Akt/GSK-3β/cyclin D1 信號通路的調控，還可通過降低Akt的活性，激活Bax和caspase-9啟動凋亡程序的功能，使Bax發生聚合反應，活化以及促進 caspase-9的下游通路蛋白caspase-3裂解活化，最終使細胞的凋亡過程得以完成。

本項目研究結果表明，Cor能明顯降低A375細胞中酪氨酸酶的活性，減少黑色素的形成，提示其潛在治療MM的作用。有學者報道，富含Cor的龍眼核多酚提取物能夠與酪氨酸酶的銅離子活性中心結合，拮抗酪氨酸酶的激活，從而抑制酶的催化作用[15]。Cor對酪氨酸酶以及黑色素形成的影響與其引起細胞凋亡的信號通路是否有潛在聯系，需要進一步實驗驗證。揭示Cor降低A375細胞中黑色素含量的機制，有助于其在黑色素瘤治療中的開發應用。

(致謝：本實驗主要在廣東藥科大學藥學院以及中心實驗室完成，感謝臧林泉教授以及藥理教研室老師的指導與幫助！)