法舒地爾對(duì)慢性阻塞性肺病合并肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺血管重構(gòu)及血漿HIF-1α、ET-1的影響

汪文淑，孫 芮，趙 磊

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,安徽 合肥 230601)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是以持續(xù)性氣流受限為特征的，可以預(yù)防和治療的疾病。COPD患者由于長(zhǎng)期缺氧及CO2潴留，肺血管重構(gòu)，右心室肥厚，甚至導(dǎo)致右心衰竭和死亡。因此，闡明COPD合并肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)的分子機(jī)制，實(shí)行盡快、盡早的干預(yù)，對(duì)減少呼吸衰竭、循環(huán)衰竭的發(fā)生，提高病人的生活質(zhì)量具有現(xiàn)實(shí)的意義。近年來(lái)研究表明，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible-factor-1α,HIF-1α)、內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)等生物活性物質(zhì)與PAH的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，法舒地爾對(duì)PAH有保護(hù)作用，可以改善肺動(dòng)脈重構(gòu)，延緩疾病進(jìn)展，具體機(jī)制尚不明確[3-5]。本研究主要觀察法舒地爾對(duì)COPD合并PAH大鼠肺血管和血漿中HIF-1α、ET-1水平的影響，旨在探究其參與COPD合并PAH的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)健康SD成年♂大鼠50只，體質(zhì)量(220±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK2011002。大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即正常組、模型組、法舒地爾組(10、20、30 mg·kg-1)，每組10只。

1.1.2 試劑 脂多糖(批號(hào)L2880，美國(guó)Sigma公司)；法舒地爾(批號(hào)H20040356，2 mL，30 mg，天津紅日藥業(yè)有限公司)；紅三環(huán)香煙(安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司)；Rho相關(guān)激酶1(Rho-associated kinase 1,ROCK1)單克隆抗體(批號(hào)ab45171，美國(guó)Abcam公司)；肌球蛋白磷酸酶靶蛋白1(myosine phosphatae targeting subunit 1,MYPT1)一抗(貨號(hào)2634)、p-MYPT1一抗(貨號(hào)4563)，均購(gòu)自美國(guó)CST公司；GAPDH一抗(北京博奧森生物有限公司)；大鼠HIF-1α及ET-1 ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。

1.1.3 儀器 YCP-160D型常壓低氧裝置(長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司)；自制煙熏箱(60 cm×80 cm×80 cm)；PowerLab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(澳大利亞AD公司)。

1.2方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備 參照文獻(xiàn)[6-7]制備COPD合并PAH大鼠模型。模型制備前，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，模型組和法舒地爾組于d 1和d 15水合氯醛麻醉后，氣管內(nèi)滴注脂多糖200 μL(1 g·L-1)，正常組注入等量的生理鹽水之后，放回原飼養(yǎng)籠進(jìn)食進(jìn)水。模型組和法舒地爾組分別于d 2～14和d 16～42，每日上午將大鼠置于自制有機(jī)玻璃箱內(nèi)香煙煙霧暴露2次，每次1 h，每次點(diǎn)燃10只卷煙。煙熏后，將大鼠放置在常壓低氧裝置中，保持室內(nèi)氧濃度10%，每天7～8 h。4周后，法舒地爾組腹腔注射法舒地爾(10、20、30 mg·kg-1)，正常組及模型組腹腔注射同等劑量的生理鹽水。至6周末，處死大鼠。

1.2.2 一般情況的觀察 觀察大鼠的飲食、毛發(fā)、體質(zhì)量、活動(dòng)量等變化。

1.2.3 右心室壓力的檢測(cè)和血漿的制備 大鼠處死前，腹腔注射10%水合氯醛(3 mg·kg-1)麻醉，備皮，暴露頸外靜脈，使用PE50管，通過(guò)右心導(dǎo)管法經(jīng)頸外靜脈測(cè)定右心室壓力[8]。測(cè)量結(jié)束后，通過(guò)導(dǎo)管心臟取血，肝素抗凝，離心取上清液，分裝于EP管中，-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于ELISA檢測(cè)。

1.2.4 右心肥厚指數(shù)的測(cè)定 放血處死大鼠，分離大鼠的心臟，生理鹽水沖洗心臟。剪去左右心房及血管組織，然后沿室間隔剪下右心室，用濾紙吸干多余水分，使用電子天平分別稱取右心室(right ventricle, RV)及左心室加室間隔重量(LV+S)，以[RV/(LV+S)]作為右心肥厚指數(shù)。

1.2.5 肺組織病理標(biāo)本的制備與分析 解剖大鼠，剪取右外下肺葉，將組織置于4%多聚甲醛緩沖液固定、脫水、透明、石蠟包埋，制備肺組織標(biāo)本。HE染色，顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.2.6 大鼠血漿中HIF-1α、ET-1的檢測(cè) 按照說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行，標(biāo)本重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.7 免疫組化法檢測(cè)肺組織ROCK1的表達(dá) 處死大鼠后，將大鼠左肺組織保存在4%多聚甲醛中，固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片，脫蠟，加入ROCK1單克隆抗體4 ℃過(guò)夜，次日加二抗，37 ℃孵育20 min，顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片，高倍鏡下觀察，陽(yáng)性顆粒呈棕黃色。

1.2.8 Western blot法測(cè)定肺組織ROCK1、MYPT1、p-MYPT1表達(dá)量 提取肺組織總蛋白，加入上樣緩沖液煮沸變性。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫封閉2 h，TBST洗膜3次，加入一抗ROCK1(1 ∶5 000)、MYPT1(1 ∶1 000)、p-MYPT1(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日加二抗(1 ∶2 000)室溫孵育1 h，洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。在Tanon全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中自動(dòng)曝光，采集圖像，采用Imaging J 1.38e圖像分析軟件進(jìn)行條帶光密度分析。以目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1大鼠的一般情況正常組大鼠活動(dòng)敏捷，應(yīng)激能力強(qiáng)，食欲良好，毛發(fā)光滑；模型組大鼠活動(dòng)量明顯減少，行動(dòng)緩慢，應(yīng)激能力減弱，食欲明顯減退，偶可聞及痰鳴音；不同劑量組法舒地爾組大鼠較模型組食欲有所好轉(zhuǎn)，活動(dòng)耐量升高。

2.2法舒地爾對(duì)COPD合并PAH大鼠體質(zhì)量的影響Tab 1的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)開始前，大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與正常組相比，模型組大鼠體質(zhì)量明顯減輕(P<0.01)；與模型組相比，法舒地爾組體質(zhì)量均明顯升高(P<0.05)，不同劑量法舒地爾組間體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab 1 Effects of fasudil on the weight of COPD rat

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

2.3法舒地爾對(duì)COPD合并PAH大鼠右心室收縮壓及右心肥厚指數(shù)的影響Tab 2結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組右心室收縮壓力、右心肥厚指數(shù)明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，法舒地爾組右心室收縮壓、右心肥厚指數(shù)均明顯降低(P<0.05)；不同劑量法舒地爾組間右心室收縮壓力、右心肥厚指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab 2 Effects of fasudil on the RVSP and RVHI of COPDrat model complicated with

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

Fig1HEstainingpulmonaryarterioles(×200)

A: Control; B: Model; C: Fasudil 10 mg·kg-1; D: Fasudil 20 mg·kg-1; E: Fasudil 30 mg·kg-1.

Fig2EffectsoffasudilonROCK-1
expressiondeterminedby
immunohistochemicalstaining(×200)

A: Control; B: Model; C: Fasudil 10 mg·kg-1; D: Fasudil 20 mg·kg-1; E: Fasudil 30 mg·kg-1.

2.4法舒地爾對(duì)COPD合并PAH大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響如Fig 1所示，正常組僅見少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道結(jié)構(gòu)正常，周圍血管壁及肺泡壁結(jié)構(gòu)正常。模型組可見肺氣腫形成，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)外彈力纖維層距離增寬，平滑肌細(xì)胞增殖明顯，管腔近于閉塞，肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞。不同劑量組法舒地爾組肺結(jié)構(gòu)破壞較模型組好轉(zhuǎn)，炎癥細(xì)胞減少，肺血管重構(gòu)減輕。

2.5法舒地爾對(duì)COPD合并PAH大鼠血漿HIF-1α、ET-1的影響Tab 3結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組HIF-1α、ET-1水平明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，法舒地爾組HIF-1α、ET-1水平明顯降低(P<0.05)；不同劑量法舒地爾組間血漿HIF-1α、ET-1含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Tab 3 Effects of fasudil on the levels ofHIF-1α and ET-1 in the plasma of COPD rat model complicated with

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

2.6法舒地爾對(duì)COPD合并PAH大鼠肺組織ROCK1表達(dá)的影響Fig 2肺組織切片免疫組化染色顯示，棕褐色顆粒主要位于肺組織支氣管肺泡上皮及肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)膜上，正常組僅見少許陽(yáng)性表達(dá)棕褐色顆粒，模型組大鼠肺組織可見大量棕褐色顆粒，法舒地爾組棕褐色顆粒明顯減少。結(jié)果表明，與模型組相比，正常組和法舒地爾組ROCK1表達(dá)明顯降低。

Fig 3 Effects of fasudil on ROCK1 and p-MYPT1 expression determined by Western )

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

2.7法舒地爾對(duì)COPD合并PAH大鼠肺組織ROCK1、MYPT1、p-MYPT1表達(dá)的影響Fig 3的Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組ROCK1、p-MYPT1表達(dá)增加(P<0.01)；與模型組相比，法舒地爾組ROCK1、p-MYPT1表達(dá)下降(P<0.05)；不同劑量法舒地爾組間ROCK1、p-MYPT1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

目前，對(duì)于COPD合并PAH大鼠模型的建立缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，宋一平等[6]采用煙熏聯(lián)合脂多糖的方法，成功復(fù)制大鼠COPD模型，該復(fù)合方法是目前最常用的制備COPD模型的方法。本研究參照其造模方法，模型建成后，大鼠出現(xiàn)呼吸急促、反應(yīng)遲鈍、精神萎靡、毛發(fā)稀少、食量明顯減少。肺組織病理提示大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺大泡形成，肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺血管重構(gòu)。右心室心腔擴(kuò)大，收縮壓增大，提示模型復(fù)制成功。

研究發(fā)現(xiàn)，Rho激酶信號(hào)通路與肺血管收縮、肺血管重構(gòu)有關(guān)。Rho蛋白是具有信息傳導(dǎo)和分子開關(guān)功能的信號(hào)多肽，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架的聚合狀態(tài)，參與多種生物行為，主要包括細(xì)胞黏附與遷移、平滑肌收縮、細(xì)胞增殖與凋亡等。Rho激酶信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子包括Rho蛋白、Rho激酶和肌球蛋白磷酸酶等。Rho激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，以2種高度同源性的異構(gòu)體形式存在(ROCK1、ROCK2)。ROCK是Rho下游的重要效應(yīng)分子，活化的ROCK一方面磷酸化其底物肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)的調(diào)節(jié)亞單位MYPT1，抑制MLCP的磷酸酶活性，減少M(fèi)LC磷酸化基團(tuán)的水解，因此p-MYPT1的表達(dá)水平是反映ROCK活性的重要標(biāo)志；另一方面，活化的ROCK可直接磷酸化MLC，增加MLC的磷酸化水平，從而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合，影響細(xì)胞的收縮、黏附、增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為和功能。Rho激酶抑制劑法舒地爾可滲透到血管平滑肌細(xì)胞，在正常或病理情況下，均與ATP 競(jìng)爭(zhēng)Rho激酶催化區(qū)的ATP結(jié)合位點(diǎn)，特異性阻斷Rho激酶活性，劑量依賴性減弱以肌動(dòng)蛋白為基礎(chǔ)的平滑肌細(xì)胞收縮反應(yīng)。臨床上，法舒地爾用藥方法主要是靜脈滴注，但本研究中采用的方法是腹腔注射，主要是因?yàn)榇笫蟮捻槒男圆睿o脈穿刺難度系數(shù)大，持續(xù)靜脈滴注難以實(shí)現(xiàn)。另外，法舒地爾半衰期短，直接靜脈注射作用持續(xù)時(shí)間短，需反復(fù)多次給藥。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠肺小動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，管腔明顯狹窄甚至閉塞，右心室收縮壓力升高，肺血管重構(gòu)，肺組織ROCK1、p-MYPT1蛋白表達(dá)明顯升高。法舒地爾組大鼠肺血管重構(gòu)明顯減輕，ROCK1、p-MYPT1蛋白表達(dá)較模型組明顯下降，肺動(dòng)脈壓力降低，右心室肥厚減輕，提示Rho激酶信號(hào)通路與COPD合并PAH有關(guān)，與既往的研究結(jié)果一致。且隨著法舒地爾用量的增加，表達(dá)均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能與用藥劑量間隔偏小、用藥時(shí)間較短、實(shí)驗(yàn)誤差等因素有關(guān)。

HIF是在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)的一種DNA結(jié)合蛋白，是低氧情況下誘發(fā)的最直接的調(diào)控因子[9-10]。HIF-1α亞單位為HIF-1獨(dú)有，為氧感應(yīng)元件，在常氧狀態(tài)下，其幾乎不表達(dá)；缺氧狀態(tài)下，HIF-1α聚集并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與核內(nèi)HIF-1β形成聚合體，繼而激活靶基因轉(zhuǎn)錄，從而組織細(xì)胞發(fā)生血管新生、重建、細(xì)胞增殖等一系列的耐氧適應(yīng)性分子反應(yīng)。ET-1主要由血管內(nèi)皮產(chǎn)生, 具有強(qiáng)烈的縮血管作用，對(duì)維持血管內(nèi)皮的平衡起重要的作用。ET-1主要通過(guò)下游的兩個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體起作用，ETα和ETβ[11-12]。選擇性的ET-α受體拮抗劑與非選擇性的內(nèi)皮素受體拮抗劑在PAH的治療中均有效。既往研究發(fā)現(xiàn)，Rho激酶抑制劑法舒地爾可以降低野百合堿和低氧誘導(dǎo)PAH大鼠HIF-1α、ET-1的水平，但是在COPD合并低氧所致PAH大鼠中是否存在相同的作用，相關(guān)報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組HIF-1α、ET-1明顯升高，提示HIF-1α、ET-1參與了COPD合并低氧誘導(dǎo)的PAH的病理生理過(guò)程。可能是因?yàn)槿毖鯛顟B(tài)下HIF-1α表達(dá)升高，調(diào)節(jié)ET-1基因的表達(dá)，引起ET-1分泌增多，內(nèi)皮舒張因子與收縮因子的平衡調(diào)節(jié)受到破壞，導(dǎo)致肺血管收縮，加重肺血管重構(gòu)[13]。應(yīng)用Rho激酶抑制劑法舒地爾后，肺組織炎癥明顯好轉(zhuǎn)，肺動(dòng)脈高壓、心室肥厚明顯降低，大鼠血漿HIF-1α、ET-1水平降低，且HIF-1α、ET-1水平隨法舒地爾劑量的升高而呈逐漸下降的趨勢(shì)，提示Rho激酶信號(hào)通路參與HIF-1α、ET-1所致的COPD合并PAH。因此，阻斷Rho激酶信號(hào)有望阻斷HIF-1α、ET-1作用通路，但其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步探究。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠COPD合并PAH模型的建立，檢測(cè)各組大鼠RVSP、RV/(LV+S)、肺組織ROCK1、p-MYPT1以及血漿HIF-1α、ET-1水平的變化，驗(yàn)證了Rho激酶信號(hào)通路在PAH過(guò)程中表達(dá)的規(guī)律，同時(shí)發(fā)現(xiàn)法舒地爾可以降低血漿中HIF-1α、ET-1水平，為臨床COPD合并PAH的診治提供了理論基礎(chǔ)。

(致謝：感謝安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室為本課題研究提供儀器設(shè)備和技術(shù)支持。)