吳茱萸堿抑制NOD1通路誘導肝癌HepG2和SMMC-7721細胞凋亡

郭星嫻，李曉朋，呂曉婷，陳 益，周 鵬，呂艷偉，李 靜，陳地龍，2

(1. 重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織細胞工程與干細胞研究室，組織學與胚胎學教研室，重慶 400016；2. 三峽醫(yī)藥高等專科學校，重慶 400016)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的高發(fā)惡性腫瘤之一，其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中位于第3位，其發(fā)病率及死亡率居高不下。HCC具有起病隱匿、進展快、易轉(zhuǎn)移、預后差、易復發(fā)等特點[1]。因此，探索如何有效治療HCC依然是現(xiàn)今的研究熱點之一。作為天然產(chǎn)物的中藥具有毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性、減輕患者的痛苦等優(yōu)勢[2]，因此，使用中藥治療肝癌受到了越來越多的重視。吳茱萸堿是吳茱萸的主要有效成分之一，藥理學研究表明，吳茱萸堿的藥理作用廣泛，其在抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等方面的作用十分重要[3]。有研究顯示，吳茱萸堿通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB ,NF-κB) p65的激活，發(fā)揮強大的抗炎和抗腫瘤效應[4]。

先天免疫系統(tǒng)由一些能夠識別微生物、病毒或異常受損的宿主細胞的受體家族組成。研究顯示，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體的免疫功能密不可分。近年發(fā)現(xiàn)，一種名為核苷酸寡聚域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors, NLRs)家族的蛋白與先天免疫反應有關[5]，并且其中的核苷酸結合寡聚化結構域蛋白1(nucleotide-binding oligomerization domain 1,NOD1)對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在一定的影響[6-7]。有研究報道，NOD1可通過誘導NF-κB p65磷酸化，介導炎癥反應和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8]。因此，我們猜測吳茱萸堿抑制肝癌細胞中NF-κB p65的激活可能與NOD1相關，但目前尚未見文獻報道。

1 材料

1.1細胞株正常肝細胞株HL-7702和人肝癌細胞株SMMC-7721、HepG2，均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)。

1.2藥物與試劑吳茱萸堿(純度98%)購自賽洛克生物科技公司；PCR試劑購自GeneCopoeia; BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、RIPA裂解液(強)、PMSF(100 nmol·L-1)、CCK-8試劑盒、Hoechst 33258染液，均購自碧云天生物技術有限公司；NOD1抗體購自Novus Biologicals；p65、p-p65抗體，均購自CST；Bcl-2、Bax、p53抗體，購自沈陽萬類科技有限公司。

1.3儀器凝膠成像儀、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；高速臺式離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)；倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)正常肝細胞HL-7702培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)液中，肝癌細胞HepG2、SMMC-7721均培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM-F12培養(yǎng)液中。將所有細胞放置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每24～48 h傳代1次。

2.2CCK-8法檢測細胞增殖取對數(shù)生長期的HepG2、SMMC-7721細胞，以1×109·L-1接種于96孔板，每孔200 μL。此實驗設計分3組，每組5個復孔。空白對照組: 未接種細胞，僅加入DMEM-F12完全培養(yǎng)基；Control組:已接種細胞并常規(guī)培養(yǎng)；吳茱萸堿組:細胞中加入含終濃度0.25、0.5、1、2、4 μmol·L-1吳茱萸堿的DMEM-F12完全培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)12、24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，37 ℃孵育2 h。在450 nm處測定其光吸收值(A)。計算12、24、48 h各組細胞生長抑制率，實驗重復3次。抑制率=(AControl組-A吳茱萸堿組)/(AControl組-A空白對照組)×100%。同時計算其半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration，IC50)，并確定藥物作用最適濃度和時間，實驗重復3次。

2.3Hoechst33258染色實驗取對數(shù)生長期的HepG2、SMMC-7721細胞，以1×107·L-1接種于已放置好蓋玻片的6孔板，每孔3 mL。該實驗分為2組，Control組：已接種細胞并常規(guī)培養(yǎng)；吳茱萸堿組：給予含終濃度0.5、1 μmol·L-1吳茱萸堿的DMEM-F12完全培養(yǎng)基。于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，取出，棄培養(yǎng)液，加入固定液固定10 min，棄固定液，清洗后加入染液，在常溫下避光染色5 min，去染色液，PBS洗滌，將貼附有細胞的蓋玻片取出，放于滴有抗熒光淬滅劑的載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察，并且采集圖片，實驗重復3次。

2.4實時定量PCR反應(qRT-PCR) 收集正常肝細胞HL-7702、肝癌細胞HepG2、SMMC-7721，加入TRIzol震蕩后，加入1 ∶1氯仿去除蛋白，加入2 ∶1異丙醇去除沉淀，提取總RNA，在260 nm和280 nm處檢測濃度，并用DEPC水配平，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用GeneCopoeia試劑，依據(jù)說明書進行操作，檢測正常肝細胞與肝癌細胞中NOD1的表達水平。體系為95 ℃反應10 min，45個循環(huán)的95 ℃反應10 s，60 ℃反應20 s，72 ℃延伸15 s，設置2個復孔，以β-actin為內(nèi)參進行PCR檢測，實驗重復3次。NOD1引物序列：正向5′-ACTGAAAAGCAATCGGGAACTT-3′,反向5′-CACACACAATCTCCGCATCTT-3′。

2.5Westernblot檢測實驗分組同“2.3”，培養(yǎng)24 h后，分別用全蛋白裂解液抽提試劑盒提取全蛋白。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各組蛋白濃度，每個樣品取20 μg蛋白上樣，SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；用5%脫脂奶粉封閉，4 ℃孵育一抗Bcl-2、Bax、p53、NOD1、p65、p-p65(1 ∶1 000)過夜。洗膜3次，37 ℃孵育二抗(1 ∶10 000)1 h，洗膜3次后，用ECL法檢測蛋白的表達。

3 結果

3.1吳茱萸堿對HepG2、SMMC-7721細胞增殖的影響Fig 1的CCK-8檢測結果顯示，吳茱萸堿(0.25、0.5、1、2、4 μmol·L-1)作用于HepG2和SMMC-7721細胞12、24、48 h后，HepG2和SMMC-7721細胞的增殖均受到明顯抑制，與Control組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且吳茱萸堿對HepG2及SMMC-7721細胞的生長抑制作用呈劑量和時間依賴性。計算12 h的IC50分別為1.8、2 μmol·L-1，24 h的IC50分別為1.1、1.3 μmol·L-1，48 h的IC50分別為0.7、0.9 μmol·L-1。故選用給予1 μmol·L-1吳茱萸堿誘導24 h進行后續(xù)實驗。

Fig 1 Inhibitiory effect of evodiamine on SMMC-7721(A) and HepG2(B) cells by CCK-8 assay n=3)

3.2吳茱萸堿對HepG2、SMMC-7721細胞凋亡的影響Fig 2的Hoechst 33258染色結果顯示，Control組發(fā)出均勻、淡藍色熒光；而吳茱萸堿誘導后的各組均出現(xiàn)核染色質(zhì)濃縮聚集、核碎裂、核邊集及發(fā)出藍白色熒光等典型的細胞凋亡形態(tài)學特征，且1 μmol·L-1吳茱萸堿組的凋亡細胞比0.5 μmol·L-1吳茱萸堿組更多。

Fig 2 Evodiamine induced SMMC-7721 and HepG2 cells for 24 h by Hoechst 33258 staining (×200)

3.3吳茱萸堿對HepG2、SMMC-7721細胞中凋亡相關蛋白表達的影響Fig 3的Western blot結果顯示，與Control組比較，吳茱萸堿組HepG2、SMMC-7721細胞中促凋亡蛋白Bax、p53表達明顯增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3.4NOD1在正常肝細胞HL-7702及肝癌細胞HepG2、SMMC-7721中的表達Fig 4的qRT-PCR及Western blot結果顯示，與正常肝細胞相比，HepG2及SMMC-7721細胞中的NOD1表達水平明顯升高，提示NOD1的高表達可能是肝癌發(fā)生、發(fā)展的誘因之一。

3.5吳茱萸堿對HepG2、SMMC-7721細胞中NOD1通路相關蛋白表達的影響Western blot檢測NOD1信號通路中的主要成員NOD1、p65、p-p65的變化，F(xiàn)ig 5結果顯示，與Control組比較，吳茱萸堿組HepG2及SMMC-7721細胞的NOD1、p-p65蛋白水平明顯降低，而p65表達水平不變。

4 討論

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，并且在全球的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，其發(fā)展迅速，不易發(fā)現(xiàn)，并且預后較差。

Fig 3 Protein expression in SMMC-7721 and HepG2 cells after evodiamine treatment for 24 h n=3)

*P<0.05vscontrol

肝癌患者的免疫力普遍較為低下，使用常規(guī)化療藥物也有可能損傷患者的免疫功能，并且治療成本較高。因此，尋找價格低廉，且能夠在抗癌的同時提高患者免疫力的藥物迫在眉睫。

吳茱萸堿為吳茱萸干燥近成熟果實中的主要有效成分之一，其抗腫瘤作用是近年來的研究熱點。國內(nèi)外大量研究證明，吳茱萸堿可以降低炎癥因子的表達，發(fā)揮強大的免疫調(diào)節(jié)功能，并且具有較強的抑制腫瘤細胞增殖、阻滯細胞周期、誘導細胞死亡和抗血管生成、抑制浸潤轉(zhuǎn)移作用，從而能夠抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移[9]。目前，在臨床上已有采用吳茱萸堿治療肝癌、結腸癌等惡性腫瘤的報道[10-11]，但對其抗癌的機制研究尚未完全清楚。

本研究采用CCK-8法檢測吳茱萸堿對肝癌細胞HepG2和SMMC-7721的增殖抑制作用。結果顯示，0.25～1 μmol·L-1的藥物在12、24、48 h均可明顯抑制上述兩種細胞的增殖，并呈時間和劑量依賴性。采用Hoechst染色檢測吳茱萸堿對肝癌細胞凋亡的影響，結果顯示，采用0.5、1 μmol·L-1吳茱萸堿誘導24 h后，肝癌細胞出現(xiàn)了核染色質(zhì)濃集，并發(fā)出亮藍色熒光等典型的細胞凋亡指征，且凋亡形態(tài)的變化程度與藥物濃度呈正相關。

Fig 4 Analysis of NOD1 mRNA (A) and protein(B) expression in normal hepatic cell lines and

*P<0.05vsHL-7702

p53蛋白是一種抑癌基因，負性調(diào)節(jié)細胞生長，與調(diào)控細胞周期、DNA修復、細胞凋亡等重要的生物學功能有關，其過表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復發(fā)及不良預后相關。Bcl-2蛋白是一種重要的抗凋亡基因，其能夠阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)，從而抑制了細胞凋亡。Bax蛋白是人體中關鍵的凋亡基因，是Bcl-2基因家族的成員之一，其過表達可拮抗Bcl-2的作用，使細胞發(fā)生凋亡。本實驗采用0.5、1 μmol·L-1吳茱萸堿作用于肝癌細胞后，與Control組相比，吳茱萸堿組肝癌細胞的凋亡相關蛋白Bax、p53表達水平增高，而抗凋亡相關蛋白Bcl-2表達水平降低，且呈濃度依賴性。研究證實，吳茱萸堿可促進肝癌細胞的凋亡，但其機制尚未完全清楚。

Fig 5 Protein expression in SMMC-7721 and HepG2 cells after evodiamine treatment for 24 h n=3)

*P<0.05vscontrol

NOD1蛋白是參與人體天然免疫的胞質(zhì)蛋白家族中的一員，是一種模式識別受體，在遺傳上高度保守，其與一些炎癥反應的發(fā)生及細胞凋亡關系密切。近年有研究發(fā)現(xiàn)，NOD1敲除小鼠顯示出對炎癥誘導的結腸腫瘤發(fā)生的敏感性增加[12]。也有研究表明，與非腫瘤組織相比，胃癌組織中NOD1受體水平明顯較高[13]。后期有研究發(fā)現(xiàn)，MCF-7細胞中，NOD1的缺失與腫瘤生長相關[14]。研究表明，NOD1在多種腫瘤細胞中呈高表達，但在肝癌細胞中NOD1的表達水平如何，尚未見文獻報道。因此，我們采用qRT-PCR及Western blot檢測了正常肝細胞HL-7702、肝癌細胞HepG2及SMMC-7721中的NOD1表達水平，發(fā)現(xiàn)與正常肝細胞相比較，HepG2及SMMC-7721細胞中的NOD1表達水平均明顯較高，揭示了NOD1的高表達可能是肝癌發(fā)生、發(fā)展的誘因之一。隨后，我們用0.5、1 μmol·L-1吳茱萸堿作用于肝癌細胞后，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，NOD1的蛋白表達明顯降低。那么，吳茱萸堿是如何通過NOD1來調(diào)控肝癌細胞凋亡的呢？

NF-κB蛋白家族主要參與機體自身的免疫反應、機體損傷和應激、細胞分化和凋亡以及腫瘤生長過程的信息傳遞，p65蛋白是其中的一員，其被磷酸化后進入細胞核，啟動其調(diào)控作用。許多凋亡相關蛋白如p53等，都是NF-κB蛋白的靶基因產(chǎn)物，p53信號通路為腫瘤發(fā)生過程中誘導凋亡的重要信號通路，Bax和Bcl-2又是p53信號通路相關的重要分子，p53可通過影響B(tài)cl-2、Bax等蛋白的表達，實現(xiàn)對細胞凋亡過程的調(diào)控作用[15]。因此，我們猜測吳茱萸堿可能通過下調(diào)NOD1的表達，影響NF-κB p65磷酸化，影響凋亡相關蛋白的表達來發(fā)揮其誘導肝癌細胞凋亡的作用。本實驗采用0.5、1 μmol·L-1吳茱萸堿作用于肝癌細胞后，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，p65蛋白表達未變，但p-p65蛋白水平下降，且呈濃度依賴性。研究證實，吳茱萸堿通過下調(diào)NOD1，抑制NF-κB的激活，激活p53信號通路，改變Bcl-2/Bax的比值，誘導肝癌HepG2和SMMC-7721細胞的凋亡。

綜上所述，吳茱萸堿對肝癌細胞HepG2和SMMC-7721有明顯抗腫瘤活性，其作用機制可能與抑制NOD1通路的激活相關，因而吳茱萸堿可作為一種潛在的NOD1抑制劑，為今后開發(fā)具有抗癌作用的同時，能夠提高患者免疫力，且價格低廉的藥物提供了一定的參考價值。

(致謝：本研究在重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織工程與干細胞研究室完成，特此感謝研究過程中給予幫助的老師及同學！)