嗎啡預(yù)處理誘導(dǎo)的大鼠血清外泌體對(duì)H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響

劉 中，產(chǎn)進(jìn)中，潘永露，黃 俊，楊 婉，張 野，何淑芳

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，安徽 合肥 230601；2.安徽省立醫(yī)院西區(qū)麻醉科，安徽 合肥 230001)

心肌缺血/再灌注損傷(ischemic reperfusion injury，IRI)是心臟及大血管手術(shù)圍術(shù)期常見并發(fā)癥，可導(dǎo)致原有心肌損害加重，嚴(yán)重影響術(shù)后心臟功能的恢復(fù)，對(duì)圍術(shù)期患者的生命安全造成巨大的威脅[1]。如何預(yù)防或減輕再灌注損傷，已成為心血管研究領(lǐng)域重要的關(guān)注點(diǎn)。心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷可在體外模擬心肌缺血/再灌注過程，有利于直接觀察受損心肌細(xì)胞的形態(tài)及功能的變化，廣泛應(yīng)用于IRI的細(xì)胞分子機(jī)制研究[2]。

外泌體是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡樣小體，直徑為30～100 nm，體內(nèi)多種細(xì)胞均可分泌。外泌體中包含豐富的蛋白質(zhì)、脂類、miRNA等，是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間物質(zhì)交換及信息傳遞的重要媒介[3]。隨著外泌體研究的不斷深入，其在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，不同起源干細(xì)胞分泌的外泌體，可以減小心肌梗死面積，抑制心肌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成，抑制炎癥反應(yīng)[4]。此外，缺血預(yù)處理能增加血液中外泌體的釋放，將這些外泌體灌注到大鼠體內(nèi)，能大大減小心肌梗死的面積，起到心肌保護(hù)作用[5]。阿片類物質(zhì)是缺血預(yù)處理發(fā)揮心肌保護(hù)作用的主要介質(zhì)之一，已知阿片類藥物預(yù)處理可模擬缺血預(yù)處理，通過激活促生存信號(hào)通路，抑制心肌細(xì)胞凋亡。嗎啡是心臟和大血管手術(shù)麻醉中廣泛應(yīng)用的鎮(zhèn)痛藥，與缺血預(yù)處理相比，具有給藥方便、無創(chuàng)傷、臨床上易于操作等優(yōu)點(diǎn)。本課題組前期研究表明，嗎啡預(yù)處理(morphine preconditioning，MPC)可明顯減輕心肌缺血后損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡[6]。在此基礎(chǔ)上，本研究擬進(jìn)一步探討MPC誘導(dǎo)釋放的大鼠血清外泌體，是否減輕心肌細(xì)胞H/R損傷，以期為阿片類藥物心肌保護(hù)機(jī)制研究提供新的思路和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株 健康成年SD大鼠，♂，體質(zhì)量(250±30)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(皖)2005-001。大鼠H9c2(2-1)胚胎心肌細(xì)胞株，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 藥物與試劑 鹽酸嗎啡注射液 1 mL：10 mg(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥廠，批號(hào)160707-2)；ExoQuickTMExosome Precipitation Solution、無外泌體血清(美國(guó)SBI公司)；DME/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone公司)；細(xì)胞增殖檢驗(yàn)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)(廣州Biosharp公司)；乳酸脫氫酶(lactic acid dehydrogenase，LDH)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；FITC Annexin V凋亡試劑盒(美國(guó)BD公司)；兔抗CD63單克隆抗體、鼠抗HSP60單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz 生物技術(shù)公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔、山羊抗小鼠抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；ECL發(fā)光試劑盒(美國(guó)Thermo公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.1.3 儀器 生物安全柜(美國(guó)Thermo公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；缺氧小室(加拿大Stem Cell公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；蛋白電泳儀、Tanon Fine Do X6全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海Tannon公司)；Tecan M 1000酶標(biāo)儀(德國(guó)Tecan公司)；Cytomics FC500 流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman有限公司)；120 kv透射電鏡(美國(guó)FEI公司)。

1.2方法

1.2.1 大鼠預(yù)處理及血清外泌體提取 SD大鼠隨機(jī)分為MPC組和對(duì)照組(CON)，每組3只。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，經(jīng)頸外靜脈微量泵泵注嗎啡(100 μg·kg-1)5 min，間斷 5 min，3個(gè)循環(huán)，即為MPC。對(duì)照組大鼠麻醉后，泵注等量生理鹽水。預(yù)處理結(jié)束后，收集大鼠血液，采用ExoQuickTM試劑盒提取血清中的外泌體。血清以3 000×g離心15 min去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，留取上清；上清經(jīng)過0.22 μm一次性濾器過濾，所得上清液按照試劑盒說明書，加入沉淀劑，混合均勻后，4 ℃放置 30 min；將孵育好的混合物4 ℃、1 500×g離心30 min，離心后外泌體呈米黃色或白色沉淀沉于管底；棄上清，再次1 500×g離心5 min，留取沉淀，即為外泌體，用400 μL PBS或DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，保存于-80 ℃，分別標(biāo)記為MPC-Exo和CON-Exo。

1.2.2 BCA蛋白定量 將0.5 g·L-1的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按照0、1、2、4、8、12、16、20 μL順序加到96孔板中，各孔加入PBS補(bǔ)足到20 μL；上述提取的外泌體樣品稀釋到合適濃度后，取5 μL加到96孔板中，加PBS補(bǔ)足到20 μL；各孔加BCA工作液200 μL，用加樣槍輕輕吹打混勻；37 ℃孵育30 min后放入酶標(biāo)儀，于波長(zhǎng)562 nm處測(cè)定各孔的吸光度。用測(cè)定的外泌體中蛋白濃度表示外泌體濃度。

1.2.3 外泌體的鑒定

1.2.3.1 透射電鏡觀察形態(tài) 取5 μL上述提取的外泌體懸液，載樣于銅網(wǎng)表面，2.5%戊二醛溶液固定，隨后滴加3%磷鎢酸室溫下負(fù)染5 min，用濾紙從銅網(wǎng)側(cè)面吸去多余的負(fù)染液，將銅網(wǎng)放在純水中2 min，洗滌3次，室溫干燥，120 kV下觀察拍攝電鏡圖片。

1.2.3.2 Western blot檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白 取上述分離得到的外泌體100 μL，加入10 μL RIPA裂解液，冰上裂解20 min，14 000×g離心10 min，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白與5×SDS上樣緩沖液混勻(體積比4 ∶1)，100 ℃煮10 min。取20 μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在含5%脫脂牛奶的TBST封閉液中室溫孵育1 h，TBST液漂洗10 min×3次，加入CD63、HSP60一抗 (1 ∶500)，4 ℃孵育過夜。d 2 TBST液漂洗10 min×3次，加二抗孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次，采用ECL發(fā)光試劑盒顯影并采集圖像。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) H9c2心肌細(xì)胞用含10%無外泌體血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞密度在80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化約2 min，以1 ∶3的比例傳代，每隔2～3 d傳代1次。

1.2.5 建立心肌細(xì)胞H/R損傷模型 參照文獻(xiàn)[7]介紹的方法，換去H9c2細(xì)胞正常培養(yǎng)時(shí)的完全培養(yǎng)基，加入無血清無糖的缺氧液(139 mmol·L-1NaCl、4.7 mmol·L-1KCl、0.5 mmol·L-1MgCl2、1.0 mmol·L-1CaCl2、5 mmol·L-1HEPES，pH 7.4)，細(xì)胞置于缺氧小室中，通入95% N2-5% CO2飽和10 min,以驅(qū)除小室內(nèi)的氧氣，隨后將缺氧小室放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h進(jìn)行缺氧，然后用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)1 h進(jìn)行復(fù)氧。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)分組及處理 H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組：①對(duì)照組(Control組)：H9c2細(xì)胞置于DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；②缺氧/復(fù)氧組(H/R)：將H9c2細(xì)胞進(jìn)行5 h缺氧和1 h復(fù)氧處理；③H/R+CON-Exo組：將CON-Exo以20 mg·L-1的終濃度加入H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，與心肌細(xì)胞共孵育12 h后，進(jìn)行H/R處理；④H/R+MPC-Exo組：將MPC-Exo以20 mg·L-1的終濃度加入H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，與心肌細(xì)胞共孵育12 h后，進(jìn)行H/R處理。

1.2.7 心肌細(xì)胞活性的檢測(cè) 將H9c2細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔104個(gè)，按上述方法進(jìn)行分組及處理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液(培養(yǎng)基100 μL)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，酶標(biāo)儀上于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各組吸光度，空白對(duì)照孔為不含細(xì)胞的培養(yǎng)液。H9c2心肌細(xì)胞活力為實(shí)驗(yàn)測(cè)定孔吸光度值減去空白對(duì)照孔吸光度值。計(jì)算各組平均值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.8 檢測(cè)LDH活性 接種在96孔板的H9c2細(xì)胞按照以上進(jìn)行分組及處理后，每組各取40 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照LDH試劑盒說明書操作，利用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定各孔吸光度，根據(jù)公式計(jì)算各組LDH活性。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.9 Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將H9c2心肌細(xì)胞以2×106個(gè)/孔接種在6孔培養(yǎng)板，按照上述進(jìn)行分組及處理，結(jié)束后，0.25%胰酶(不含EDTA)消化，PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000×g離心5 min，收集細(xì)胞，用500 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞，每組加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻后，室溫避光反應(yīng)15 min，隨即流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。以單染Annexin-V-FITC細(xì)胞和單染PI細(xì)胞作為基準(zhǔn)參照，每個(gè)樣本獲取3×104個(gè)細(xì)胞，以FCS Express V 3.0軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1大鼠血清外泌體的鑒定對(duì)分離得到的外泌體進(jìn)行鑒定，電鏡下可見圓形或橢圓形囊泡結(jié)構(gòu)，大小較均一，直徑在30～100 nm之間(Fig 1A)。Western blot結(jié)果表明，其中含有外泌體標(biāo)志性蛋白CD63、HSP60(Fig 1B)。說明已從大鼠血清中成功提取了血清外泌體。BCA蛋白定量結(jié)果是CON-Exo(7.23±0.25) g·L-1，MPC-Exo(14.87±1.29)g·L-1，用測(cè)定的外泌體中蛋白濃度表示外泌體濃度，說明MPC可誘導(dǎo)血清外泌體釋放明顯增加(P<0.01，F(xiàn)ig 1C)。

2.2MPC-Exo增加H9c2心肌細(xì)胞活力心肌細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 2)，與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01)；與H/R組相比，H/R+MPC-Exo組細(xì)胞活力增加(P<0.01),而H/R+CON-Exo組細(xì)胞活力無明顯增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明MPC-Exo能增加細(xì)胞活力。

2.3MPC-Exo降低H9c2心肌細(xì)胞LDH的活性細(xì)胞損傷的程度可以用細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的水平來表示。如Fig 3所示，與對(duì)照組相比，H/R組心肌細(xì)胞H/R損傷后LDH活性明顯增加(P<0.01)；與H/R組相比，H/R+MPC-Exo組可減輕心肌細(xì)胞H/R損傷，降低H9c2心肌細(xì)胞LDH的活性(P<0.01),H/R+CON-Exo組LDH活性無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明MPC-Exo可降低H9c2心肌細(xì)胞LDH的活性。

Fig 1 Isolation and characterization of exosomes

2.4MPC-Exo減少H9c2心肌細(xì)胞凋亡Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，F(xiàn)ig 4結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H/R組凋亡細(xì)胞(右上象限、右下象限)明顯增多(P<0.01)。與H/R組相比，H/R+MPC-Exo組凋亡細(xì)胞明顯減少(P<0.05),而H/R+CON-Exo組心肌細(xì)胞凋亡率無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明MPC-Exo能減少H9c2心肌細(xì)胞凋亡，減輕H/R損傷。

Fig 2 MPC-Exo increased cell viability

##P<0.01vsCON;**P<0.01vsH/R

Fig 3 MPC-Exo reduced LDH activity

##P<0.01vsCON;**P<0.01vsH/R

3 討論

外泌體可通過運(yùn)載內(nèi)源性蛋白、脂質(zhì)、miRNA等作用于靶細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞間的信息交流，在正常的生理功能過程以及疾病的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，外泌體能向受體細(xì)胞傳遞蛋白質(zhì)和遺傳信息[8]，從而介導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)傳遞。外泌體在心血管疾病中具有重要作用，近年來得到廣泛關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體可以介導(dǎo)HSP70蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，激活心肌細(xì)胞內(nèi)ERK和p38 MAPK通路，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[9]。間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體能明顯減小小鼠的心肌梗死面積，通過增加腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)的水平，減少氧化應(yīng)激，激活PI3K/Akt通路，從而減輕IRI[10]。在小鼠心肌IRI模型中，心臟祖細(xì)胞來源的外泌體可以明顯減輕心肌細(xì)胞凋亡，并且發(fā)現(xiàn)這些外泌體含有豐富的miR-451，能促進(jìn)血管生成，改善心臟功能[11]。這些均表明外泌體具有心肌保護(hù)作用，如果缺血心肌在早期得到具有心肌保護(hù)性的外泌體預(yù)處理，其心肌損傷的程度可以得到一定的逆轉(zhuǎn)，這可能為缺血性心臟病提供了一種新的治療方法。

Fig 4 MPC-Exo decreased rate of cell apoptosis

A: Representative scatter plots of the flow cytometry data for each group; B: Cell apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry. Apoptotic rates were expressed as the relative number of apoptotic cells versus total cells.##P<0.01vsCON;*P<0.05vsH/R.

嗎啡是一種主要作用于μ受體的激動(dòng)藥，具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛性，是廣泛應(yīng)用于心臟和大血管手術(shù)圍術(shù)期鎮(zhèn)痛的常用藥物。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，MPC具有缺血預(yù)處理類似的心肌保護(hù)作用，減輕心肌IRI[12]，其機(jī)制仍待進(jìn)一步探討。本研究通過在大鼠體內(nèi)進(jìn)行MPC，預(yù)處理結(jié)束后收集血液，隨后分別提取MPC組和對(duì)照組血清中的外泌體，結(jié)果表明MPC組外泌體濃度明顯高于對(duì)照組，表明MPC誘導(dǎo)了外泌體的產(chǎn)生，增加了外泌體的進(jìn)一步釋放。有研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)嗎啡處理后，培養(yǎng)液中外泌體釋放量明顯增加，其攜帶的miR-29b可被鄰近神經(jīng)元攝取，從而調(diào)控基因表達(dá)，說明外泌體介導(dǎo)的miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)可能是嗎啡發(fā)揮生物學(xué)作用的一個(gè)重要途徑[13]。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證MPC誘導(dǎo)釋放的大鼠血清外泌體對(duì)H/R損傷的影響，將MPC-Exo與H9c2心肌細(xì)胞共孵育12 h，隨后進(jìn)行H/R損傷，研究結(jié)果表明，MPC-Exo能增加H9c2心肌細(xì)胞活力，降低LDH的活性，減少心肌細(xì)胞凋亡，而CON-Exo并未有此作用。心肌細(xì)胞凋亡是IRI中的重要事件，本研究發(fā)現(xiàn)的MPC誘導(dǎo)釋放的大鼠血清外泌體能明顯減少心肌細(xì)胞損傷與凋亡，從而減輕H/R損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，這對(duì)進(jìn)一步了解外泌體對(duì)心肌細(xì)胞功能的影響具有重要價(jià)值。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理可以刺激富含miRNA-144的外泌體的釋放，而miRNA-144激活PI3K/Akt和ERK信號(hào)通路，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[14]。缺血預(yù)處理后提取間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(mesenchymal stem cells derived exosomes，MSC-Exo)，發(fā)現(xiàn)其富集miR-22，在體實(shí)驗(yàn)證明MSC-Exo可以減少心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化，主要機(jī)制可能與miR-22對(duì)其目標(biāo)蛋白甲基化的CpG結(jié)合蛋白-2的作用有關(guān)[15]。我們前期研究證明，MPC通過上調(diào)心肌細(xì)胞miR-133b-5p水平，抑制H/R損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[6]。據(jù)此，我們推測(cè)MPC誘導(dǎo)釋放的血清外泌體可能攜帶包括miR-133b-5p在內(nèi)的心肌保護(hù)性miRNA，作用于心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，但這一推論仍待進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究主要是在H9c2細(xì)胞上進(jìn)行的，H9c2細(xì)胞是大鼠胚胎心肌細(xì)胞株，因其易于培養(yǎng)且可傳代，故廣泛應(yīng)用于體外研究。但它不同于原代的乳鼠心肌細(xì)胞和成年心肌細(xì)胞，因而MPC誘導(dǎo)釋放的大鼠血清外泌體是否能夠減輕原代心肌細(xì)胞H/R損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明，MPC誘導(dǎo)釋放的大鼠血清外泌體可以減輕H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，為阿片類藥物心肌保護(hù)機(jī)制研究提供了新的思路和靶點(diǎn)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)中心完成，感謝各位老師和同學(xué)的幫助。)