抑制NF-κB的活化對(duì)免疫性肝損傷大鼠CYP1A2的影響

林 琴，賈金雪，王 濤，李曉霞，劉鳳婷，薛永志

(包頭醫(yī)學(xué)院藥物代謝與肝臟分子藥理研究所，藥理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

CYP1A2在肝臟細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)藥物代謝酶總含量中所占比例僅次于CYP3A和CYP2C亞家族，居于第3位，可參與多種外源性藥物及內(nèi)源性類固醇激素的代謝，也參與多種前毒物或前致癌物質(zhì)，如芳香胺類、黃曲霉素及雜環(huán)胺類的代謝活化過(guò)程[1-2]。以往對(duì)CYP1A2代謝功能的研究多著重于該酶在化學(xué)毒物代謝中的作用及機(jī)制，而對(duì)其在病毒性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌等免疫性肝損傷過(guò)程中的作用和調(diào)控機(jī)制尚不清楚[3]。核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear factor kappa B，NF-κB)是調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)及細(xì)胞存活的重要因子[4-5]，也涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成。炎癥和組織損傷過(guò)程中，NF-κB激活，調(diào)控大量下游炎性細(xì)胞因子，可能參與損傷過(guò)程。吡咯烷二硫氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)可以通過(guò)抑制IκB的磷酸化，從而發(fā)揮抑制NF-κB的作用[6]，因此,可以阻止NF-κB向核內(nèi)移位，減少下游細(xì)胞因子的表達(dá)。本研究以尾靜脈注射卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)制備大鼠免疫性肝損傷模型，觀察CYP1A2的代謝活性蛋白表達(dá)有何變化，采用PDTC抑制NF-κB活化，觀察對(duì)CYP1A2氧化代謝活力和肝功能的影響，深入探討NF-κB在免疫性肝損傷中的作用及其作用環(huán)節(jié)，為免疫性肝損傷藥物治療提供新的靶點(diǎn)和思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑清潔級(jí)♂SD大鼠，內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量(250±20)g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蒙)2005-0001。BCG凍干粉(60 mg/支，1 g·L-1)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：2015-01；PDTC(批號(hào)：851002)、茶堿(批號(hào)：057k0691)，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；組織蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、CYP1A2兔抗大鼠多克隆抗體、β-actin鼠多克隆抗體，均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2儀器高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；DF-D型恒壓恒流電泳儀(北京市六一儀器廠)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；快速混勻器(姜堰市新康醫(yī)療有限公司)；7600-020型自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)。

1.3動(dòng)物分組及免疫性肝損傷模型的制備SD大鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，稱重編號(hào)后，按隨機(jī)數(shù)字表分為control、BCG、BCG+PDTC(50、100、200 mg·kg-1)組，每組12只。BCG、BCG+PDTC組尾靜脈注射BCG 125 mg·kg-114 d制備免疫性肝損傷大鼠模型，Control組尾靜脈注射等體積生理鹽水。采用NF-κB特異性抑制劑對(duì)BCG+PDTC組進(jìn)行干預(yù)(d 11、12、13的16時(shí)腹腔注射PDTC各1次，劑量分別為50、100、200 mg·kg-1)。d 14用于高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定CYP1A2代謝活力實(shí)驗(yàn)，隨后將大鼠頸椎脫臼處死，迅速剖取肝臟、脾臟，稱重。將部分肝組織浸泡于事先配好的甲醛酒精(甲醛 ∶酒精=1 ∶9) 固定液中，做石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色。稱取部分肝組織用于CYP450總含量測(cè)定，另稱取部分肝組織凍存，用于Western blot檢測(cè)。

1.5大鼠肝組織勻漿中CYP450全酶含量的測(cè)定BCG刺激2周后(d 14晨)，各組動(dòng)物均取定量12只肝臟制備肝勻漿樣本,按1 ∶4比例向肝組織勻漿樣本中加入預(yù)冷的0.15 mol·L-1Tris-HCl緩沖液，通入CO氣體2 min，聯(lián)二亞硫酸鈉還原樣本后，用雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定490 nm、450 nm處光密度差值。采用BCA法測(cè)定肝勻漿樣本中蛋白的含量，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每毫克蛋白中CYP450全酶含量。

1.6Westernblot檢測(cè)肝組織CYP1A2表達(dá)肝組織稱重后，勻漿制備蛋白抽提物，用BCA法蛋白定量，SDS-PAGE電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，放入0.02 mol·L-1TBS緩沖液配制的5%脫脂奶粉和1%的BSA混合的封閉液內(nèi)，搖床搖動(dòng)，室溫封閉2 h。漂洗，CYP1A2兔多克隆抗體、β-actin鼠多克隆抗體雜交，加二抗，顯色，X線片曝光，用紫外透視成像系統(tǒng)對(duì)X線片進(jìn)行光密度分析。

1.7血清肝功能檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transarninase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平使用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

2 結(jié)果

Tab 1 Effect of PDTC on liver and spleen weight relative to body weight ratio, serum levels of ALT and AST, in BCG induced hepatic injury rats in vivo n=12)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsBCG

2.1PDTC對(duì)BCG誘導(dǎo)的免疫性肝損傷大鼠肝臟病理組織學(xué)、肝重/體質(zhì)量、脾重/體質(zhì)量、血清轉(zhuǎn)氨酶含量的影響經(jīng)尾靜脈注射BCG 2周后，光鏡下觀察到肝實(shí)質(zhì)及匯管區(qū)周?chē)写罅繂魏思?xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，形成大小不等，且彌漫性分布的大量肉芽腫團(tuán)塊為特征的免疫性肝損傷(Fig 1)。Tab 1結(jié)果顯示，肝臟重量增加(P<0.05)，脾臟重量增加，PDTC可降低肝臟、脾臟重量的增加；血清AST、ALT均升高(P<0.01)，PDTC可抑制AST、ALT的升高。

Fig 1 Pathological features of liver (HE, ×200)

A: Control group; B: BCG group.

2.2PDTC對(duì)BCG誘導(dǎo)的免疫性肝損傷大鼠肝勻漿中CYP450總含量的影響Tab 2結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，尾靜脈注射BCG 14 d后，肝臟CYP450全酶含量明顯減少(P<0.01)。在BCG刺激的基礎(chǔ)上給予工具藥PDTC進(jìn)行干預(yù)，可劑量依賴性地減緩肝臟CYP450全酶含量減少(P<0.05)。

Tab 2 Effect of PDTC on CYP450 total content in homogenate sample of BCG stimulated rats n=12)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsBCG

Fig 2 Plasma theophylline levels in all groups n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsBCG

Tab 3 Plasma theophylline pharmacokinetic levels

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsBCG

2.4各組大鼠CYP1A2表達(dá)的變化Fig 3的Western blot 結(jié)果顯示，內(nèi)參β-actin可見(jiàn)各條帶密度均一，提示蛋白定量基本準(zhǔn)確，各組蛋白上樣量基本一致。BCG組肝組織中CYP1A2蛋白的表達(dá)明顯低于control組，PDTC預(yù)處理后CYP1A2蛋白的表達(dá)有所恢復(fù)。

Fig 3 CYP1A2 expression in all groups n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsBCG

3 討論

我國(guó)人群中發(fā)生的免疫性肝損傷多為病毒、原蟲(chóng)等微生物感染所致，免疫應(yīng)答在清除病毒的同時(shí)，肝細(xì)胞也受到損傷，是病毒性肝炎、肝硬化最終發(fā)展為肝細(xì)胞癌的重要發(fā)病機(jī)制之一，嚴(yán)重威脅人類的健康[6]。由于人類肝炎病毒不能自然地在嚙齒類動(dòng)物肝臟進(jìn)行復(fù)制，尋找合適的動(dòng)物模型進(jìn)行免疫性肝損傷研究一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者亟待解決的問(wèn)題。大鼠經(jīng)尾靜脈注射BCG兩周后，觀察到肝實(shí)質(zhì)及匯管區(qū)周?chē)写罅繂魏思?xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，大鼠肝、脾重量增加，轉(zhuǎn)氨酶增加，表明免疫性肝損傷大鼠模型造模成功，與人類病毒性肝炎的病理改變頗為一致，可以用于病毒性肝炎的代謝酶變化及其調(diào)控機(jī)制的研究。

CYP1A2 酶約占肝臟中CYP450酶總量的13%，參與臨床約5%藥物的代謝，如華法林、茶堿、氯氮平、替加氟等[3]，是重要的藥物代謝酶之一。本實(shí)驗(yàn)觀察到，BCG免疫損傷刺激導(dǎo)致大鼠肝臟CYP450酶總含量降低，給予工具藥PDTC抑制NF-κB激活，可減緩肝藥酶全酶的含量降低。研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，免疫損傷過(guò)程中，占CYP450酶系13%左右的CYP1A2表達(dá)和代謝活力下調(diào)，鈍化NF-κB激活可抑制其下調(diào)，推測(cè)CYP1A2的下調(diào)可能與NF-κB調(diào)節(jié)有關(guān)。當(dāng)臨床上CYP1A2酶活力下調(diào)與經(jīng)其代謝的藥物聯(lián)用時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致被代謝藥物在體內(nèi)因清除率降低而蓄積，從而引發(fā)藥物相互作用，產(chǎn)生一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，研究免疫性肝損傷狀態(tài)對(duì)CYP1A2酶活性的影響，進(jìn)而評(píng)估藥物之間是否存在相互作用，具有重要的臨床意義。BCG免疫刺激可誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞或肝枯否細(xì)胞表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，繼而生成大量NO。NO作用于CYP1A2的鐵蛋白中心，使CYP1A2破壞增加，使其下調(diào)[7-8]。NF-κB能與許多細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的基因啟動(dòng)子區(qū)域的固定核苷酸序列結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用[9]。這可能是本研究中觀察到的抑制NF-κB活化，可減緩肝臟代謝酶CYP1A2的表達(dá)和代謝活力降低，緩解肝臟損傷的分子機(jī)制之一。代謝酶恢復(fù)正常，可以認(rèn)為是肝功能恢復(fù)的一個(gè)方面。

炎癥和免疫損傷性刺激，導(dǎo)致腸黏膜屏障受損，腸道通透性增加，致使內(nèi)毒素血癥，iNOS大量誘生，NO合成增加，內(nèi)毒素可以通過(guò)結(jié)合枯否細(xì)胞上CD14受體來(lái)激活NF-κB，活性氧可能是所有刺激物激活NF-κB共同機(jī)制和LPS誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)通路的核心，活性氧誘生能減少巰基，從而增加細(xì)胞被氧化的比例，調(diào)節(jié)NF-κB激活。NF-κB可增加氧化信號(hào)通路的敏感性，導(dǎo)致基因產(chǎn)物的增多[10-12]。iNOS既是NF-κB的激活物，同時(shí)，又受到NF-κB的調(diào)控，抑制NF-κB的活化可以減少NO的誘生，減緩CYP1A2的下調(diào)。關(guān)于免疫性肝損傷過(guò)程中CYP1A2代謝活力是否經(jīng)由NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控，調(diào)控了下游哪些炎性細(xì)胞因子，能否通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控代謝酶活力干預(yù)損傷過(guò)程，有待進(jìn)一步深入研究。