縮氨基硫脲-喹唑啉衍生物S-2BEBD對A549細胞增殖的影響及機制研究

劉海彬, 沈繼偉，邊圣杰，吳英良

(1. 遼寧科技學院生物醫藥與化學工程學院，遼寧 本溪 117004；2. 沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，遼寧 沈陽 110016)

肺癌是目前死亡率最高的惡性腫瘤之一，約85%的肺癌為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。晚期NSCLC的治療一直是肺癌治療領域的一個難點，隨著腫瘤分子靶向治療的開展，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制劑為晚期NSCLC的治療帶來了新的希望[1-2]。惡性腫瘤生長失控，侵害周圍組織并發生轉移，這些過程在某種程度上受病理性的細胞信號轉導所控制。信號傳至胞內，誘導細胞增殖或抑制細胞凋亡。受體蛋白酪氨酸激酶就是其中一類過度表達的信號蛋白[3]。EGFR是一種受體蛋白酪氨酸激酶，能夠介導多條信號通路的轉導，將胞外信號傳遞至胞內，對正常細胞和腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡均發揮重要的調節作用。因此，選擇性抑制EGFR介導的信號轉導途徑以達到治療腫瘤的目的，已成為近年來腫瘤治療研究的熱點。

縮氨基硫脲及其衍生物由于具有廣泛的生物活性，如抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗結核、抗瘧等，備受人們的重視[4-6]。縮氨基硫脲化合物的抗腫瘤活性是由于該化合物能夠抑制DNA的合成，將核苷酸還原為脫氧核苷酸[7]。喹唑啉化合物通過抑制EGFR、血管內皮生長因子受體、血小板衍生生長因子受體等其他多個作用靶點，在抗癌、抗菌、抗真菌、抗炎、抗驚厥等藥物化學領域受到廣泛關注[8-9]。喹唑啉類化合物作為一種較成功的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑受到了廣泛的重視。研究表明，喹唑啉類化合物通過與作用位點結合，高度選擇性地抑制EGFR的磷酸化，從而抑制腫瘤細胞的生長[10]。以EGFR為靶點的喹唑啉類藥物，如拉帕替尼(lapatinib，LPTN)、吉非替尼和厄洛替尼已經上市，用于NSCLC的治療[11]。

盡管對靶向的小分子抑制劑的研究已有長足進展，但目前仍有很多方面不甚了解，其更完善的作用機制、適用范圍及用藥方式尚待進一步研究。由于EGFR抑制劑在使用過程中逐漸出現耐藥現象，因此尋找新的EGFR抑制劑顯得尤為迫切。作者合成了含有縮氨基硫脲結構的喹唑啉類衍生物S-2BEBD[12-14]，其結構式見Fig 1。研究發現，S-2BEBD對MCF-7、A549和PC3腫瘤細胞表現出較高的體外細胞抑制活性，并且與LPTN相比，S-2BEBD顯示出更高的活性[14]。為了探索S-2BEBD的作用機制，本文從細胞凋亡形態、細胞周期、caspase-3相對活性等方面，與LPTN進行比較，研究S-2BEBD對人肺癌A549細胞增殖及凋亡的影響。

Fig 1 Structures of S-2BEBD (A) and LPTN (B)

1 材料與方法

1.1細胞與試劑人肺癌細胞A549購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。S-2BEBD按文獻方法[14]合成；拉帕替尼購自百靈威公司；RPMI 1640培養基購自Gibco公司；胎牛血清購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；Western blot抗體購自Santa Cruz公司；MTT購自Ameresco公司；吖啶橙(acridine orange，AO)、碘化丙啶(propidium iodide, PI)、核糖核酸酶A(RNaseA)，均購自Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器CJ-1F型醫用凈化工作臺(蘇州市金燕凈化設備有限公司)；XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)；DMLS2型正置熒光顯微鏡(德國Leica公司)；Multiskan MK3型酶標儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)；FACS Calibur流式細胞儀(美國Becton Dickson公司)。

1.3細胞培養將人肺癌細胞A549接種于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中培養，置于飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養箱中，傳至3代后，待細胞狀態穩定即可實驗。

1.4細胞增殖檢測MTT法檢測S-2BEBD和LPTN對A549細胞的增殖抑制作用。取對數生長期的A549細胞，接種于無菌96孔細胞培養板中，每孔加入180 μL的細胞懸液，培養24 h，分別加入濃度為1 000、100、10、1、0.1 μmol·L-1的LPTN和S-2BEBD兩種藥，每個濃度設3個復孔。培養72 h后，每孔加入濃度為5 g·L-1的MTT溶液20 μL，培養4 h，每孔加入150 μL DMSO溶液，充分震蕩，酶標儀492 nm處測吸光度值(OD)，計算細胞的增殖抑制率。增殖抑制率=(陰性對照組OD值-實驗組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。利用SPSS 16.0軟件計算IC50。實驗重復3次，取平均值。

1.5倒置顯微鏡下觀察細胞形態取對數生長期的A549細胞接種于96孔細胞培養板，每孔180 μL細胞懸液，細胞數為5×103/孔，培養24 h后，加入濃度為4.0 μmol·L-1的S-2BEBD，同時設陰性對照組(只含DMSO的培養基)，藥物作用24、48、72 h后，光學顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.6AO染色檢測凋亡細胞取對數生長期的A549細胞接種于24孔板，5×104/孔，每孔1.0 mL培養液，培養24 h后，加入S-2BEBD(2.25、4.5、6.0 μmol·L-1)，藥物作用24、48、72 h后，每孔加入1 mL PBS緩沖液，10 μL AO染液，熒光顯微鏡下觀察細胞形態。

1.7流式細胞術檢測細胞周期變化采用同上方法處理A549細胞，24 h后加入S-2BEBD(3、2.25、1.5、0.75 μmol·L-1)，各瓶培養液終體積為8 mL。繼續培養，于加藥24、48、72 h后收集細胞，吸除培養基，PBS沖洗3次，胰酶消化，懸浮液轉移至離心管，離心后，棄上清，加20 μL RNase溶液，然后再加入30 μL PI染液，流式細胞儀檢測。

1.8Westernblot檢測采用同上方法處理A549細胞，加入S-2BEBD 24 h后，提取細胞質蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜后，5%脫脂奶粉封閉，再加入相對應的一抗，4 ℃搖床孵育3 h，將膜在TBST緩沖液中漂洗3次，用封閉液稀釋二抗，室溫下孵育2 h后顯影。檢測p-EGFR、EGFR、p-Akt、Akt、p-ERK1/2、ERK1/2等蛋白表達水平。

2 結果

2.1S-2BEBD對A549細胞體外增殖抑制作用的量效、時效關系LPTN作為陽性對照藥，Fig 2結果表明，S-2BEBD和LPTN對A549細胞增殖具有明顯的抑制作用，S-2BEBD的抑制活性強于LPTN。S-2BEBD對A549細胞體外增殖的抑制作用明顯，隨著濃度的增大、時間的延長，抑制作用也明顯增強。提示S-2BEBD對A549細胞體外增殖的抑制作用具有劑量和時間依賴性。

Fig 2 Time and concentration-response curves of S-2BEBD (A) and LPTN (B) on A549 cells n=3)

2.2S-2BEBD對A549細胞形態的影響倒置顯微鏡觀察A549細胞的形態學變化。如Fig 3所示，對照組A549細胞生長狀態良好，形態規則，呈圓梭形，貼壁生長，輪廓清楚，細胞生長較旺盛。S-2BEBD 4.0 μmol·L-1處理組A549細胞均表現出細胞皺縮，細胞膜表面不光滑，貼壁能力減弱，胞質中出現顆粒狀物質，染色質凝集，部分細胞形成凋亡小體。時間越長，作用效果越明顯。

2.3AO染色觀察凋亡細胞如Fig 4所示，對照組A549細胞的核染色質著綠色，并呈正常結構，細胞結構完整，邊緣清晰，而藥物處理組的細胞核形狀則發生了明顯的改變，48 h時出現了染色質濃縮、斷裂、邊緣化；72 h后出現凋亡小體等典型細胞凋亡特征，且隨著S-2BEBD濃度的增高，凋亡特征越明顯。提示S-2BEBD以時間和劑量依賴性的方式誘導A549細胞發生凋亡。

Fig 3 Morphological changes of A549 cells after treatment with S-2BEBD (×400)

A: 12 h; B: 24 h; C: 48 h; D: 72 h.

2.4LPTN、S-2BEBD對A549細胞周期的影響流式細胞術檢測發現，20 μmol·L-1的LPTN作用A549細胞24～48 h，SubG1期細胞明顯增加，柱形圖上可見明顯的凋亡峰，G0/G1期細胞明顯減少，S期和G2/M期細胞隨著時間的延長先升高，后降低。1.5 μmol·L-1的S-2BEBD作用A549細胞24～72 h，G0/G1細胞明顯減少，S期細胞逐漸增加，差異有統計學意義；G2/M期細胞先升高，后又發生明顯的降低(Tab 1、Fig 5)。

2.5S-2BEBD對A549細胞凋亡及信號蛋白表達的影響首先檢測了LPTN和S-2BEBD對肺癌A549細胞中EGFR及下游信號蛋白ERK、Akt磷酸化的影響。Fig 6結果顯示，與對照組相比，LPTN(20 μmol·L-1)和S-2BEBD(4.5、5.25、6.00 μmol·L-1)能夠以劑量依賴性的方式明顯下調p-EGFR、p-Akt、p-ERK l/2蛋白的表達，而對非磷酸化的EGFR、Akt、ERK l/2表達無明顯影響。

Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達，Fig 7結果顯示，cleaved caspase-3的表達隨S-2BEBD濃度增高而增加。LPTN和S-2BEBD通過促進促凋亡蛋白Bax的激活，抑制Bcl-2的活性，誘導A549細胞的凋亡。

Fig 4 Morphological changes of A549 cells after treatment with S-2BEBD by a fluorescent microscopy (×400)

A: Control; B: S-2BEBD 4.5 μmol·L-124 h; C: S-2BEBD 4.5 μmol·L-148 h; D: S-2BEBD 4.5 μmol·L-172 h; E: Control; F: S-2BEBD 2.25 μmol·L-148 h; G: S-2BEBD 4.50 μmol·L-148 h; H: S-2BEBD 6.00 μmol·L-148 h.

Fig 5 Effect of LPTN and S-2BEBD on apoptosis and cell cycle of A549 cells

Tab 1 Effects of LPTN and S-2BEBD on apoptosis and cell cycle of A549 cells n=3)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol

Fig 6 Effects of LPTN and S-2BEBD on phosphorylation status of EGFR, ERK1/2 and Akt in A549 cells

Fig 7 Effects of LPTN and S-2BEBD on expression of caspase-3, Bcl-2 and Bax in A549 cells

3 討論

EGFR信號傳導途徑在腫瘤細胞的增殖、損傷修復、侵襲及新生血管形成中起重要作用，近年來，EGFR靶向藥物已成為腫瘤治療研究的新熱點[15]。自20世紀90年代中期起，喹唑啉類化合物對EGFR的抑制作用，使其成為抗癌藥物的主要研發對象之一。近年來，眾多研究者對喹唑啉類化合物進行了更深入的構效關系和作用機制研究，顯示出此類化合物的優良抗癌潛力，有望篩選出高效抗癌臨床藥物。前期作者合成了含有縮氨基硫脲結構的喹唑啉類衍生物，研究顯示，S-2BEBD對多種腫瘤細胞表現出較高的體外抑制活性。

本實驗將LPTN和S-2BEBD分別作用于肺癌A549細胞系72 h，經過MTT比色分析，表明LPTN和S-2BEBD體外抗腫瘤細胞增殖的作用具有明顯的劑量和時間依賴性。分別考察了不同濃度S-2BEBD作用下細胞形態和細胞周期，發現均有明顯的變化，即存在著劑量依賴性，且考察了S-2BEBD對A549細胞作用不同時間的細胞周期和細胞形態，也均有明顯的變化，即存在著時間依賴性。S-2BEBD能夠以劑量依賴性的方式明顯下調p-EGFR、p-Akt、p-ERKl/2蛋白的表達水平，并且cleaved caspase-3的表達隨S-2BEBD濃度增高而增加。同時，LPTN和S-2BEBD通過誘導Bax的激活，抑制Bcl-2的活性，誘導A549細胞的凋亡。

綜上所述，S-2BEBD對肺癌細胞系A549具有抑制增殖、誘導凋亡作用，其機制可能與下調p-EGFR、p-Akt、p-ERK l/2、Bcl-2蛋白的表達水平有關。本研究表明S-2BEBD具有潛在的臨床應用前景，可以為S-2BEBD對NSCLC的治療提供一定的理論基礎。

(致謝：本課題完成于沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院藥理實驗室，在此對實驗室的各位老師、同學的幫助表示由衷的感謝！)