印度塊菌-云南松菌根際土壤細菌的種群組成和群落結構

鄧曉娟,閆興富,劉建利,劉培貴

1 北方民族大學生物科學與工程學院,銀川 750021 2 中國科學院昆明植物研究所生物多樣性與生物地理學重點實驗室,昆明 650201

德國微生物學家Lorenz Hiltner于1904年首次提出了根際(rhizosphere)的概念,根系的表面以及受根系直接影響的土壤區域稱為根際,根際內的微生物數量和種類遠遠高于根際外的微生物數量和種類[1]。植物根系分泌的有機酸、碳水化合物等代謝產物,為微生物的生長和繁殖提供了有益條件,因此在植物的根際里定殖有很多生命活動旺盛的土壤微生物,使根際成為植物、土壤和微生物及其環境相互作用的中心,在植物和土壤之間構成了一個活躍的物質和能量交換界面[2]。根際里定殖的微生物稱為根際微生物,包括細菌、真菌、放線菌、藻類和原生動物,根際微生物的種類和數量遠遠高于非根際微生物[3-4]。

大多數陸生植物的根系都會和菌根菌形成菌根,這種互惠共生關系在自然界中十分普遍[5]。植物的根和菌根菌在土壤中形成了一個完整統一的生態系統,因此在原有根際概念的基礎上,菌根際(mycorrhizosphere)的概念就普遍使用,包括了菌根菌和菌根共生體[6]。菌根菌將其從共生植物處獲得的碳源轉化成海藻糖(trehalose),這種雙糖能夠選擇菌根根際中特定的細菌類群,在菌根菌和根際細菌相互作用的過程中扮演了很重要的角色[7-8]。同時,菌根改變了植物根的代謝功能,菌根菌的存在使菌根根際的微生物組成和根際的微生物組成具有很大的差別[9-10]。菌根對其周圍微生物群落進行選擇和調節,使其更有利于菌根本身的形成和發展[11]。真菌能否順利的侵染植物的根并形成菌根,不僅取決于其周圍的非生物因素,如土壤pH值、肥力、濕度和溫度,也取決于包括根際微生物在內的生物因素[12]。

塊菌在商業貿易領域被稱為松露,是一種地下菌根真菌,因含有豐富的氨基酸和具有獨特的香味兒而享譽世界。塊菌在歐洲是一種奢侈頂級食材,被稱為“世界珍味之王”,同魚子醬、鵝肝醬并稱為法式三大美食。塊菌在市場上最為常見的種類有三種,包括產于歐洲的黑孢塊菌(Tubermelanosporum)和意大利白塊菌(T.magnatum),以及產于亞洲的印度塊菌(T.indicum)。印度塊菌主產于我國的云南、四川和西藏,每年以出口創匯為主,是我國西南地區農民收入的重要來源。一方面,印度塊菌產區農民在經濟利益的驅使下,在印度塊菌成熟前開始采挖,且采挖方式落后粗暴,導致自然塊菌資源迅速耗竭,生境受到嚴重的破壞,印度塊菌資源面臨著瀕危,部分商業化采集區域已瀕臨絕跡。另一方面,印度塊菌的純培養困難,加劇了印度塊菌自然資源所受到的壓力[13- 14]。為了緩解這種壓力,相關研究人員一直在嘗試人工合成塊菌菌根進而實現人工栽培。中國科學院昆明植物研究所科研人員經過十多年的努力,塊菌種植園已成功產出了印度塊菌子實體(http://www.cas.cn/ky/kyjz/201212/t20121220_3725060.shtml)。在塊菌菌根人工合成過程中,pH值、基質配比等非生物因素的影響已經有很多研究報道[15- 17],而微生物對于塊菌菌根形成的影響鮮有報道。在菌根際的細菌類群中,有些類群可以促進菌根的形成,被稱之為菌根促生細菌(plant grow-promoting rhizobacteria, PGPR),研究根際細菌種群組成和群落結構是探索塊菌菌根促生細菌的前提條件[18-21]。到目前為止,關于印度塊菌菌根際細菌的種群特征還未有報道。

在分子生物學技術被運用于環境微生物的研究之前,人們對微生物的認識基本靠傳統的分離和純培養技術。盡管對于復雜環境中微生物的純培養技術已經有了很大的發展和改進[22],可培養的微生物還是不能很好的反映土壤微生物群落的多樣性。通過傳統分離方法可以獲得并進行過研究的微生物種群數量只占自然界微生物總數的0.1%—1%[23]。高通量測序技術(high-throughput sequencing)又稱為“下一代”測序技術,能以一次并行對幾萬條至幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短為標志,能夠有效探測土壤微生物多樣性[24- 25]。本文通過傳統培養的方法,以及高通量測序技術,對印度塊菌-云南松菌根根際細菌的種群組成和群落結構進行了研究,對其根際細菌多樣性及優勢類群進行了探討。

1 研究材料和方法

1.1 樣品位置和采集

云南省楚雄市是印度塊菌主要的出產地,本研究選取云南省楚雄州姚安縣左門鄉后山的純云南松林為樣品采集地,面積約1000 m2,海拔2221—2330 m,土壤為偏堿性的石灰質土壤(pH介于6—8范圍),含碳量22.12—89.22 g/kg,平均含鈣量17.3 g/kg。

在采樣地發現塊菌后,取出子囊果,編號后放入自封袋中保存。用一把鋒利且較長的小刀輕輕撥開塊菌子囊果下方的泥土,發現菌根后,以其為中心,取半徑1 cm以內的所有土樣,放入15 mL離心管中保存,注明采集號,帶回實驗室處理。共采集到6份印度塊菌×云南松菌根際土壤,選取其中3份為本次實驗樣品。

1.2 塊菌菌根際土壤可培養細菌的分離純化和鑒定

1.2.1 樣品的處理

稱取印度塊菌×云南松菌根際土壤樣品0.5 g,加入5 mL滅菌的生理液(NaCl 0.85%)稀釋成10-1菌液。同時制備10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀釋液,用以細菌的分離培養。

1.2.2 細菌的分離純化

分別在10-4、10-5和10-6的稀釋濃度下培養細菌, TSA培養基生化培養箱28℃條件下培養。每個濃度的平板設置3個重復。

1.2.3 可培養細菌的鑒定和分析

對分離培養的單菌落進行擴大培養,挑取菌落進行鑒定。每份樣品挑取的菌落數繪制物種累積曲線,當挑選的菌落數增加而種類不變時,不在增加挑選樣本的數量。對細菌的單菌落提取總DNA,擴增16S rDNA(通用引物27f/1378r)序列(擴增程序常規)。將擴增片段送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果通過NCBI上的Blast功能進行比對,當序列的相似度大于97%時被歸屬為同一個分類操作單元(OTU)。使用SeqMan(DNASTAR Package)對序列進行編輯,采用Clustal 3 version 1.81[26]進行多序列自動比對,并通過BioEdit Version 5.0.9[27]手動調整矩陣。系統發育分析采用Tamura[28]的方法。

1.3 菌根際土壤細菌基因組總DNA的提取和分析

1.3.1 基因組總DNA的提取

取0.5g左右的菌根際土壤,使用MP公司的FastDNA Spin Kit for Soil(116560- 200)試劑盒,按照其說明書完成對菌根際土壤微生物基因組總DNA提取。

1.3.2 16S rRNA V1—V3區擴增和高通量測序

擴增體系：5 μL 5×FastPfu緩沖液,2.5 μL 2.5×10-3mol/L dNTPs,1.0 μL 0.5×10-5mol/L 27F引物(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′),1.0 μL 0.5×10-5mol/L 533R引物(5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC- 3′),10 ng模板以及0.5 μL Fast Pfu Polymerase,最后加ddH2O到25 μL。獲得的PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,將擴增產物送至上海美吉生物醫藥科技有限公司,利用羅氏454Titanium測序儀完成高通量測序序列分析。

1.3.3 測序數據分析

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在對序列進行分析中,去除不含樣品信息的序列。過長序列末端的質量會降低,在分析時去除序列尾部的低質量序列。序列中含有模糊堿基(ambiguous)、單堿基高重復區(homologous)以及長度過短的序列,將這些序列納入分析會降低分析質量,因此修剪、去除此部分序列,得到供精準分析的優化序列,并將序列提交至NCBI數據庫進行分類操作單元(Operational Taxonomic Units, OTU)分析。生物信息分析中,測序得到的每一條序列來自一個菌。要了解一個樣品測序結果中的菌種、種屬等信息,需要對序列進行歸類操作。通過歸類操作,將序列相似性達到97%歸為一個OTU,使用最大似然法聚類分析OTU。

2 研究結果和分析

2.1 菌根際可培養細菌多樣性

在10-5和10-6的稀釋濃度下,細菌在TSA培養基能夠形成清晰獨立的菌落(圖1),選擇菌落數在20—200的培養皿,挑選細菌純化培養,總計得到菌根際土壤細菌796株。

圖1 印度塊菌×云南松菌根際可培養細菌Fig.1 Culturable bacteria from Tuber indicum × Pinus yunnanensis mycorrhizosphere

圖2 可培養細菌菌落數量和OTUs之間的物種累積曲線 Fig.2 Species accumulation curves between OTUs and numbers of culturable bacterial clone in mycorrhizosphere

對可培養細菌菌落進行測序分析,根據物種累積曲線(圖2),126株細菌被測序,其中76條序列(代表了61個OTUs)被用于本實驗分析。通過比對,在NCBI上下載39條序列,總計115條細菌16S rDNA序列用于此次分析。排序后得到了長度為1611 bp的序列矩陣,其中580個為信息位點(parsimony-informative),129個非信息位點(parsimony-informative)。啟發式搜索的最大簡約性分析產生了31棵同等簡約樹,步長為2035,一致性指數(CI)為0.650,留存指數(RI)為0.812。

基于根際可培養細菌16S rDNA序列構建的最大簡約數表明(圖3),以2條大腸桿菌(Escherichiacoli)的16S rDNA序列為外類群(Clade 4),印度塊菌×云南松菌根際細菌的76條序列很好的聚在了3個Clades里。Clade 1包含了下載的27條隸屬于丙型變形菌門假單胞菌屬(Pseudomonas)序列,66條(代表了51個OTUs)本次實驗獲得的序列。Clade 2包含了下載的6條隸屬于乙型變形菌門不動細菌屬(Acinetobacter)序列,6條(代表了6個OTUs)本次實驗獲得的序列。Clade 3包含了下載的4條隸屬于放線菌門鏈霉菌屬(Streptomyces)序列,4條(代表了4個OTUs)本次實驗獲得的序列。

研究結果表明,印度塊菌×云南松菌根際可培養細菌分屬于3個屬的61個OTUs,其中假單胞菌屬(Pseudomonas)序列占83.6%,不動桿菌屬(Acinetobacter)序列占9.8%,鏈霉菌屬(Streptomyces)序列占6.6%。印度塊菌×云南松菌根際可培養細菌具有較低的多樣性,其中假單胞菌是其絕對優勢類群。

圖3 基于根際細菌16S rDNA序列構建的最大簡約樹中的一棵分支上的數字為≥50%的靴帶值Fig.3 One of most parsimonious trees based on the analysis of 16S rDNA sequences in mycorrhizosphere. Numbers above branches indicate bootstrap support above 50%

2.2 菌根際細菌高通量測序結果分析

圖4 菌根際土壤細菌可變區序列的數量和OTUs之間的Rarefaction曲線分析Fig.4 Rarefaction curve between OTUs and sequences of bacteria in mycorrhizosphere

提取印度塊菌×云南松菌根際土壤細菌總DNA,擴增其16S rRNA V1-V3區并高通量測序,總計得到8937條序列2073個OTUs。根據對其測序數量和OTUs數量之間的關系進行Rarefaction曲線分析(圖4),當測序數量在8937條,相似度設為97%時,OTUs的數量還在增加,但曲線趨于緩和,測序數量可以滿足分析要求。

研究結果表明,印度塊菌-云南松菌根際土壤細菌類群具有較高的多樣性,物種種類豐富,優勢菌群集中。變形菌門、放線菌門和酸桿菌門細菌是印度塊菌-云南松菌根際土壤細菌的優勢類群,黃桿菌屬、根瘤菌屬和假黃色單胞菌屬細菌是印度塊菌-云南松菌根際土壤細菌。

3 討論

塊菌的代謝產物影響其周圍的土壤理化性質以及共生植物根部微生物的類群,使得塊菌生長并形成子囊果的地方,大部分草本植物枯死,形成無草或少草的火燒區式的“菌塘”。菌塘土壤微生物種群和塊菌之間的關系緊密而復雜。土壤微生物通過影響真菌的生態適應性,從而影響真菌的生長、分布及子囊果的形成和氣味成分的形成[29]。菌塘內和菌塘外的土壤細菌類群的結構不同,黑孢塊菌的菌塘內,隸屬于厚壁菌門、放線菌門和黃桿菌科的細菌為優勢類群,其種類和數量遠遠高于菌塘外土壤細菌的種類和數量[30]。

圖5 根際細菌OTUs在不同門的分布Fig.5 OTUs distribution in bacterial phylum

圖6 根際細菌OTUs在不同屬的分布Fig.6 OTUs distribution in bacterial genus

塊菌不僅影響菌塘內的細菌種群結構,同時也會影響菌根際細菌的群落結構。在過去十年,塊菌菌根合成的研究技術已經取得了長遠的進步,獲得諸多組合式樣的菌根合成案例[15- 17]。隨著菌根技術的發展,人們越來越認識到,除了非生物因素的影響,根際促生細菌(PGPR)對菌根的合成是否成功扮演著不可缺乏的角色[31]。隨著研究深入,在人工合成菌根的過程中,添加根際促生細菌成為一種現代且有效的生物技術手段[32]。盡管很多根際促生細菌的相關研究已經報道,但塊菌菌根促生細菌的相關研究鮮有報道[32- 33],關于印度塊菌的菌根促生細菌研究還未見報道。本研究首次揭示了印度塊菌×云南松菌根際細菌的種群組成和結構特征,為研究印度塊菌的菌根促棲菌奠定了基礎。

根據本次研究結果,印度塊菌×云南松菌根際可培養細菌以假單胞菌為絕對優勢類群。假單胞菌為革蘭氏陰性細菌,能在植物根際土壤中大量增殖,許多菌株對植物有抑制病害、 促進生長的作用,其中熒光假單胞菌(P.fluorescens)成為近幾十年來研究報道最多、最具應用價值前景的一類生防菌[34]。假單胞菌也是沙漠塊菌(Terfeziaclaveryi)菌根際土壤可培養細菌的優勢類群,且其中孟氏假單胞菌(P.mandelii)明顯的提高了菌根的侵染率,被認為是一種良好的菌根促生細菌被用于菌根合成生產中[35]。假單胞菌除在塊菌菌根際土壤里是優勢類群,也是波氏塊菌(T.borchii)菌根根尖以及意大利白塊菌和沙漠塊菌(Te.boudieri)子囊果里的優勢類群[36- 38]。假單胞菌是印度塊菌×云南松菌根際可培養細菌的優勢類群,在印度塊菌的菌根促生細菌的研究時,假單胞菌為最理想的候選類群。

采用高通量測序技術,擴增細菌16S rRNA V1—V3區進行測序分析,印度塊菌×云南松菌根際土壤細菌類群具有很高的多樣性,其中變形菌門、放線菌門和酸桿菌門是其優勢類群。同樣采用高通量測序技術研究發現,夏塊菌(T.aestivum)的菌根際土壤細菌同樣是以放線菌門和變形菌門為優勢類群[20]。放線菌門、變形菌門、擬桿菌門細菌也是黑孢塊菌菌根際土壤細菌的優勢類群[39]。在黑孢塊菌的子囊果成熟過程中,菌根際微生物雖有動態變化,但都是以α-變形菌門和γ-變形菌門細菌為優勢類群[40]。以上研究所取土壤類型、塊菌和共生宿主植物都不一致,但菌根際土壤細菌優勢類群具有相似性,變形菌門和放線菌門細菌為菌根際土壤細菌優勢類群。本研究結果為印度塊菌的菌根合成、種植園精細管理以及根際土壤微生物功能的研究奠定了基礎,明確了方向。

當研究菌根際土壤微生物多樣性時,相比新一代的高通量測序的方法,傳統平板培養的方法會錯過很多類群和重要信息。但是,對于根際細菌的功能研究,以及細菌對菌根真菌的促生作用的研究,都離不開對細菌的傳統平板培養方法。因此,本實驗不僅采用高通量測序的方法,全面揭示了印度塊菌菌根際土壤微生物的種群組成,同時采用傳統的平板培養的方法,對其可培養細菌進行了分離并鑒定,為菌根際細菌的功能研究,以及菌根促生菌的篩選提供重要數據。

致謝：中國科學院昆明植物研究所劉培貴研究員給予支持,山東省農業科學院喬鵬博士幫助樣品采集,特此致謝。