去勢小鼠椎體骨質疏松和終板重塑導致椎間盤退變

肖志鋒 林定坤,* 何劍波 蘇國義 侯宇 陳樹東

1. 廣州中醫藥大學-嶺南醫學研究中心中醫骨傷科實驗室，廣東 廣州 510405 2. 廣東省中醫院，廣東 廣州 510120

腰痛和神經放射性疼痛是椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)的主要臨床癥狀[1-2]，嚴重的IVDD常導致脊柱不穩或殘疾，給人類帶來巨大的痛苦和沉重的社會經濟負擔[3]。然而，目前還沒有有效的方法來修復退變的椎間盤，進一步明確IVDD的關鍵病理機制和開發有效的治療藥物仍是急需解決的問題。

終板是椎體和椎間盤錨定的過渡結構，是椎體與椎間盤聯系的橋梁，椎間盤營養的供給主要通過上、下終板從椎體中獲取[4-6]。在循環壓力載荷下終板的液體流動是椎間盤攝取營養和排泄廢物的主要方式[7-8]。椎體骨質疏松(osteoporosis，OP)時骨髓的微環境改變和終板骨化導致的骨髓運輸通道阻塞減少可能會誘使和加重IVDD。有證據表明OP參與IVDD過程，絕經后婦女椎體OP與其發生IVDD相關[9-10]，同時荷爾蒙水平可以影響IVDD的嚴重程度[10-12]。然而一部分研究顯示OP可以增加終板的滲透性從而延緩IVDD，二者是負相關的[8,13-14]。因此，椎體OP是否直接影響IVDD，椎體代謝如何影響到椎間盤仍不明確。本研究通過評估OVX小鼠的脊柱微病變，包括椎體、終板及椎間盤，進一步明確絕經后椎體OP是否可導致IVDD以及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和實驗設計

30只8周齡SPF級健康C57BL/6 J雌性小鼠，購于廣州中醫藥大學實驗動物中心[SCXK (粵) 2013-0034]，飼養于22 ℃～25 ℃，40%～60%相對濕度環境下，晝夜交替，自由飲食。適應性飼養3 d后小鼠隨機分為CT組(Control組)和OVX組(OVX組)，每組15只。兩組分別行假手術和雙側卵巢摘除，之后每周記錄小鼠的體重變化。造模12周后處死小鼠，獲取L4/5脊柱節段用于后續實驗。本實驗通過廣州中醫藥大學實驗動物中心倫理委員會倫理審查，按照實驗動物使用和關懷指導原則進行。

1.2 Micro-CT分析

獲取L4/5脊柱節段，立即浸入4%多聚甲醛溶液中4 ℃固定72 h，樣本用PBS沖洗3次，每次15 min，待測。根據Bian等[15]報道的方法，脊柱樣本(n=6)用于高分辨率Micro CT掃描(Skyscan1172)。簡要過程如下：掃描參數設定為電壓59 kv，電流100 μA，層厚9 μm；掃描圖片分別使用NRecon v1.6軟件和CTAn v1.9軟件進行重建和分析，使用CTvox v3.0軟件進行三維圖像重建。L4/5的冠狀面三維圖像用于終板及椎間盤的形態分析。應用CTAn v1.9軟件定義椎體、終板、椎間盤的感興趣區，200層連續感興趣區于椎體的三維重建，椎間盤感興趣區定義為L4/5椎體間不可見區域。終板定義為覆蓋在椎體表面的可見骨性結構。

1.3 組織病理學和免疫組織化學檢測

L4/5節段脊柱(n=9)浸入10%的中性EDTA(PH=7.4)溶液中常溫脫鈣14 d，流水沖洗4 h后，梯度脫水并石蠟包埋，樣本進行4 μm冠狀面切片，之后進行番紅O-固綠染色以及免疫組織化學染色。番紅O-固綠染色根據說明書操作(賽維爾公司，武漢)，免疫組織化學染色根據Abcam/Santa Cruz 標準操作流程進行。簡要過程如下：切片脫蠟，水化，EDTA(PH=8.0)抗原修復液中微波加熱至沸騰20 min，冷卻至室溫，3%H2O2處理10 min 阻斷內源性過氧化物酶，山羊血清封閉常溫封閉15 min，一抗 Col2 (Abcam，ab34712，1∶200)，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(Santa Cruz，sc-7269，1∶200) 4 ℃孵育過夜。陰性對照組用PBS孵育。免疫組化步驟根據北京中杉金橋公司PV-6001免疫組化二步法操作流程進行，DAB顯色后，蘇木素復染細胞核15 s，黃棕色代表陽性。免疫熒光實驗，切片避光孵育Alexa Fluor?555標記熒光二抗(CST Corporation，USA，#4409) 1 h，DAPI染核10 min，利用顯微鏡進行觀察和拍照(Olympus DP80，Japan)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 OVX小鼠的大體觀，子宮形態、重量及體重變化

大體觀顯示OVX組小鼠腹腔內可見大量脂肪堆積(圖1 A，空心箭頭)；實驗結果顯示，CT組和OVX組小鼠體重隨時間不斷增加，而OVX組體重增加較CT組更為明顯(圖1 B)。同時出現明顯的子宮萎縮，重量減輕，與CT組相比，差異具有統計學意義(*P<0.05)(圖1C、D)。

圖1 OVX對小鼠體重及子宮的影響。A、B：小鼠大體形態和重量(空心箭頭指示腹腔脂肪堆積)；C、D：子宮形態和重量

2.2 OVX小鼠L4/5脊柱節段椎體、終板微結構及椎間盤體積變化

Micro-CT結果顯示OVX組小鼠骨小梁明顯稀疏、變細(圖2 A)，骨小梁結構參數顯示OVX組小鼠L4椎體骨體積分數(BV/TV)、骨小梁數量(Tb.N)以及骨小梁連接密度(Conn.Dn)與CT組相比明顯降低(*P<0.05)，而骨小梁變異系數(Tb.pf)及模型指數(structure model index，SMI)明顯升高(*P<0.05)，差異有統計學意義。骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間距(Tb.sp)及開放性孔隙率[Po(op)]兩組間差異無統計學意義，但OVX組小鼠骨小梁在Tb.sp 和 Po(op)上有上升趨勢(圖2)。同時，OVX組小鼠終板中出現明顯骨化重塑，終板表面孔隙增加(圖3，箭)，伴隨著椎間盤間隙變窄，體積減少，與CT組相比差異具有統計學意義(*P<0.05)，(圖3)。

圖2 OVX對小鼠骨微結構和參數的影響。A：骨微結構；B：孔隙率；C：骨體積百分比；D：骨小梁數量；E：骨小梁厚度；F：骨小梁間距；G：骨小梁變異系數；H：骨小梁連接密度；I：模型指數

2.3 OVX小鼠椎間盤的病理改變

病理結果顯示CT組椎間盤形態結構正常，椎間盤髓核組織中大量脊索細胞被大量細胞外基質包繞，終板為大量軟骨細胞組成的透明軟骨(圖4 A、C)。OVX組小鼠出現明顯的IVDD，可見髓核減少、基質降解和形態結構紊亂(圖4B，箭頭)；番紅O-固綠染色可見終板被染成與骨組織相同的深綠色，表明蛋白多糖丟失(圖4B)；可見終板骨化和增厚，出現髓腔(圖4D，雙向箭頭)，軟骨潮線不斷上移(圖4D，箭頭)及表面靠近髓核的軟骨終板不斷變薄、活性細胞不斷減少(圖4D)。

2.4 OVX小鼠椎間盤中Col2、VEGF的表達

免疫組織化學結果顯示，與CT組相比，OVX組小鼠椎間盤中Col2表達明顯降低，尤其在終板骨化重塑區和外層纖維環丟失明顯(圖5，箭頭)。免疫熒光顯示VEGF在OVX小鼠椎間盤終板中顯著升高(圖6，箭頭)，有趣的是OVX小鼠終板中Col2降低的區域與VEGF升高的區域基本一致，這預示著二者是相互影響的致病因素，無血管椎間盤終板的骨化重塑和血管新生可能是IVDD的重要環節。

圖3 OVX對終板結構及椎間盤體積的影響(箭頭示終板孔隙及微結構改變)

圖4 OVX小鼠椎間盤的番紅O-固綠染色。A：CT組小鼠椎間盤形態結構基本正常；B：OVX組小鼠椎間盤可見明顯退變，形態結構紊亂，終板明顯骨化增厚；C和D：終板局部高倍放大圖

圖5 OVX小鼠椎間盤中Col2的表達。A、B：終板；C、D：髓核；E、F：纖維環。箭頭指示終板和纖維環中Col2表達顯著降低

圖6 OVX小鼠椎間盤VEGF的表達(箭頭指示VEGF表達)

3 討論

OP和IVDD是最為常見的脊柱退行性疾病，臨床上它們常相互伴隨，然而它們間的相互關系卻不明確。本研究顯示小鼠卵巢切除可導致椎體OP、終板骨化重塑和肥大、孔隙增加，從而導致IVDD。終板中Col2表達降低伴隨VEGF表達明顯升高，表明異常的終板骨化和血管新生參與OP介導的IVDD過程。

既往研究顯示，年齡、性別、肥胖、遺傳、免疫、營養、炎癥、機械力、損傷等多種因素均參與IVDD進程[14，16]。然而不論何種因素，IVDD是一個脊柱功能單位(包括相鄰的結構如椎體、終板、韌帶等)退變的過程[5-6，11]。椎間盤作為無血管組織，其代謝和力學主要受椎體及終板的影響，因此椎體及終板病變(如OP)可能是誘發椎間盤緩慢發生退變的起始因素。一些研究顯示椎體OP時牽張應力的改變與多節段IVDD增高的許莫氏結節發生率相關[17]。此外，磁共振成像椎體終板下骨信號改變可以作為活動性IVDD的評判標準[18]。作為椎間盤與椎體間物質交換和生物力學傳導的橋梁，終板的結構和功能完整是影響椎間盤的關鍵因素[19-20]，而終板界面結構的損壞可能是引起力學和生物因素惡性循環，推進IVDD進展的中心環節。一些研究發現，OP時終板的骨化重塑引起終板孔隙及滲透性降低而促進OP介導的IVDD過程[6]，相反另一些研究顯示OP可以增加終板孔隙和滲透性延緩IVDD[8]，這些結論基于椎間盤主要依賴終板從椎體獲取營養。然而本研究顯示椎體OP、終板骨軟骨重塑引起終板孔隙及滲透性增加促使了IVDD的發生，這可能與終板孔隙滲透增加導致抗原暴露、免疫炎癥反應及椎間盤髓核內壓逐漸丟失有關。有研究顯示骨保護素基因敲除后OP小鼠椎間盤出現血管新生及炎癥因子增加，預示著OP誘導了椎間盤的血管侵入和炎癥反應[21]。此外，終板的Modic改變與腰痛關系密切[5，22]，伴隨有終板Modic改變的人群IVDD更為嚴重。OP人群髓核更易于突入終板發生IVDD，終板損傷亦可造成正常的髓核內壓不能維持進而導致蛋白多糖的降解丟失促使IVDD[23]，這些證據說明OP及終板損害是造成IVDD的不可或缺的因素。

Col2是軟骨組織中含量最豐富的物質，它的含量對正常椎間盤功能尤為重要[24]，本研究結果顯示OVX后小鼠椎間盤中Col2表達減弱，特別在終板骨化重塑區和外層纖維環。同時相應區域的VEGF顯著上升，說明OP介導的終板骨化重塑、終板滲透性的增高和血管新生不是為椎間盤提供更多的營養，而是促使Col2的降解以及椎間盤的纖維化和退變。總之，本研究顯示雌激素缺乏OP是造成IVDD的不利因素，椎體、終板結構的完整是椎間盤正常生理機能的保障。作為發揮“生物半透膜”功能的終板，只有完整的結構，合適的終板滲透性，才能在保證椎間盤正常的營養需求的同時又避免對椎間盤內微環境的干擾，以及維持髓核適當的滲透內壓，確保椎間盤的代謝和功能。