生髓健骨膠囊對酒精性骨質疏松大鼠股骨生物力學影響的研究

任樹軍 梁彥林 任明輝 王墉琦 譚福柱 邢國利 姜益常

1. 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040 2. 黑龍江中醫藥大學研究生院，黑龍江 哈爾濱 150040 3. 西安市中醫院，陜西 西安 710001 4. 黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040

酒精性骨質疏松[1-3](alcohol-induced osteoporosis，AOP)屬繼發性骨質疏松范疇，是指長期、大量飲酒導致骨礦含量、骨密度、骨量減少而致骨微觀結構破壞及骨力學性能下降，引起骨折風險性增加的一種全身骨代謝性疾病。酒精濫用和酒精依賴導致骨壞死的發生率正逐漸增加，且缺乏具體量化標準，已成為眾多國內外學者的研究方向[4]。自Saville在1965年發現過度飲酒者尸體標本的骨量顯著降低后，眾多學者在研究中證實過度飲酒主要通過改變[5]骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、成骨細胞、破骨細胞等的增殖、分化，引起脂肪組織增多，造成骨組織形成減少等一系列病理生理變化。主要通過抑制成骨、促進骨吸收，導致骨質疏松最終形成[6-7]。

骨生物力學[8](biomechanics)是在生物力學理念上來分析人體在遭受創傷、各種病變以及手術后的力學特性，通過其理論對其生物學效應來指導臨床骨折及軟組織損傷的研究，促進了人體肌肉骨骼系統疾病在臨床和基礎研究上的進展，更加有效地對各種創傷、畸形、退變性疾病進行診斷和治療，從而對骨生物力學有更深的認識，提高了臨床療效[9]。

本研究通過建立酒精性骨質疏松癥大鼠模型，觀察不同時期的酒精引起模型鼠股骨作用力的變化特征，探討酒精在骨質疏松癥形成過程中的作用機制，以研究生髓健骨膠囊對酒精性骨質疏松大鼠股骨生物力學的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供清潔級雄性SD大鼠120只，動物合格證號：SCXK(黑)201701030，平均月齡約6個月，體重(220±20)g。按隨機數字表法分為正常對照組、模型組、西藥對照組、中藥干預組4組，每組各30只，分籠喂養，適應性喂養1周后，稱大鼠體重。

1.2 實驗主要儀器及藥物

1.2.1實驗儀器：游標片尺(精確度0.02 mm，長150 mm)，北京儀器廠生產。電子萬能試驗機(AGS-10KNG型)，日本島津公司生產。

1.2.2主要藥物：生髓健骨膠囊(規格：0.35 g/粒)，黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，批準文號：黑衛藥制字Z20110036；碳酸鈣片[規格：500 mg/片(以鈣計)]，吉林萬通藥業有限公司，批準文號：國藥準字H10980201；阿法D3(規格：0.25 μg/粒)，以色列TEVA藥廠生產，昆明貝克諾頓公司分裝，批準文號：國藥準字J20130162；白酒(規格：500 mL/瓶)，紅星牌55度二鍋頭白酒，北京紅星股份有限公司生產，生產許可證QS110015010349，批號：GB/T20822；生理鹽水(規格：500 mL/袋)，四川太平洋藥業有限公司，出廠批號：B1708018。

1.3 實驗方法

健康清潔級雄性SD大鼠白酒灌胃法造模。按10 mL/(kg·d)[含純酒精約4.4 g/(kg·d)]的劑量，每日灌胃1次，共持續16周。每周稱體重1次，以調整白酒的用量。分別在8、12、16周時灌胃后禁食禁水12 h后采集標本，進行指標檢測。

正常對照組：每日上下午用等量生理鹽水灌胃2次。模型組：每日上午用白酒(按10 mL/kg的體重劑量)灌胃+等量生理鹽水灌胃，每日各1次。西藥對照組：每日上午白酒(按10 mL/kg的體重劑量)灌胃+碳酸鈣片[按85 mg/(10 mL·kg)]和阿法D3[按0.05μg/(10 mL·kg)]以生理鹽水配成混懸液灌胃給藥(相當于成人等效劑量的10倍)，每日各1次。中藥干預組：每日上午白酒(按10 mL/kg的體重劑量)灌胃+生髓健骨膠囊按4.7 g/(10 mL·kg)(相當成人等效劑量的10倍)以生理鹽水配成混懸液灌胃給藥，每日各1次。以上各組大鼠灌胃容積為10 mL/kg，灌胃給藥時間共持續16周。實驗期間各組大鼠自由進食和飲水，并給予全價標準營養顆粒飼料。每周稱1次體重，根據體重調整用藥劑量。

1.4 取材及檢測方法

于干預造模后8、12、16周時，用頸椎脫位斷髓法處死各組實驗大鼠，立即剖出包括股骨頭及股骨內外髁在內的完整左側股骨，剔除殘余結締組織及肌肉，在生理鹽水中沖洗并用生理鹽水濕紗布包敷，用游標卡尺分別測出股骨中段外徑，算出截面面積并用電子萬能試驗機進行股骨三點彎曲試驗[10](加載點在股骨中段，支點跨距20 mm，加載速度2 mm/min)。計算骨生物力學指標為最大載荷、極限強度、最大撓度、彈性模量。

將制備好的股骨放置于電子萬能試驗機上，測量兩支座間的距離，即跨距，確定加載點。放置好后調整試驗機十字頭的位置，使之于股骨完全接觸的壓力值為0，設定十字頭運動加速度、試驗機量程、原始位移等參數，進行實驗。

1.5 統計學分析

所得實驗數據用SPSS 19.0軟件進行t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠體重變化情況

造模前各組大鼠體重差異無統計學意義(P>0.05)。造模后4周空白組與模型組相比較，空白組體重明顯高于模型組(P<0.01)。用藥8、12、16周后西藥對照組、中藥干預組與模型組相比，體重均明顯升高(P<0.01)；西藥對照組與中藥干預組相比較，差異有統計學意義(P<0.05)，說明西藥對照組體重明顯低于中藥干預組。見表1。

表1 各組大鼠體重變化比較

注：與正常對照組相比，★P<0.05，★★P<0.01，☆P>0.05；與模型組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01，△P>0.05；與西藥對照組相比，●P<0.05，●●P<0.01，△P>0.05。

造模前各組體重相比較，差異無統計學意義(P>0.05)。造模后4周時正常對照組與模型組對比，正常組體重明顯高于模型組(P<0.01)。與模型組相比，用藥8、12、16周后西藥對照組、中藥干預組體重均明顯升高(P<0.01)；西藥對照組與中藥干預組相比較，差異有統計學意義(P<0.05)，說明中藥干預組體重明顯高于西藥對照組。

2.2 各組大鼠股骨結構力學性能比較(表2～4)

表2 用藥8周時各組大鼠股骨結構力學性能比較

注：與正常對照組相比，★P<0.05，★★P<0.01，☆P>0.05；與模型組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01，△P>0.05；與西藥對照組相比，●P<0.05，●●P<0.01，△P>0.05。

各組大鼠左側股骨生物力學指標測定結果顯示，模型組與空白組比較，大鼠股骨的最大載荷、極限強度、最大撓度、彈性模量均顯著降低(P<0.01)。中藥干預組和西藥對照組均有不同程度的改善(P<0.05)。中藥干預組最大載荷、極限強度、最大撓度均優于西藥對照組，而彈性模量經比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 用藥12周時各組大鼠股骨結構力學性能比較

注：與正常對照組相比，★P<0.05，★★P<0.01，☆P>0.05；與模型組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01，△P>0.05；與西藥對照組相比，●P<0.05，●●P<0.01，△P>0.05。

表4 用藥16周時各組大鼠股骨結構力學性能比較

注：與正常對照組相比，★P<0.05，★★P<0.01，☆P>0.05；與模型組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01，△P>0.05；與西藥對照組相比，●P<0.05，●●P<0.01，△P>0.05。

3 討論

隨著經濟的發展，酒的消耗量也在增加。在各種社交中，飲酒往往是最常見的一種方式，而飲酒發生的悲痛教訓值得我們重視[11]。酗酒主要抑制成骨細胞和BMSCs的增殖而促進其向成脂細胞的分化[5，12]。骨細胞內脂質沉積，打破了骨吸收和形成的動態平衡，從而使骨皮質變薄、骨小梁數量減少、骨髓腔增大、骨礦化障礙等一系列病理改變，導致骨生物力學的改變[13-16]。《素問·本神篇》云：“脾藏營，營舍意，脾氣虛則四肢不用，五臟不安”，《素問·痿論》曰：“脾主身之肌肉”，肌肉豐滿壯實乃骨骼強壯的力學保證[17-18]。骨生物力學常通過骨結構力學特征變化和內在質量來反映其抵抗破壞和變形能力的大小?，F常用的骨生物力學試驗是三點彎曲試驗，主要測定骨組織對抗外力后的力學特征和生物學效應[19-20]。實驗測定的指標包括最大載荷、最大撓度、彈性模量和極限強度，其中最大載荷直接反映骨小梁的骨質、結構的連續性、骨皮質的強度等，是對骨質量的綜合反應；最大撓度可反映出骨小梁在垂直于軸線方向上的線位移，即最大變形長度；彈性模量為衡量股骨產生彈性變形難易程度的指標，其指越大，發生一定彈性變形的應力也越大，即剛度越大，亦即在一定應力作用下發生彈性變形越小；極限強度即導致骨折所需的應力[21-22]。上述指標主要反映出骨的結構力學特征的變化，它主要受到骨重建過程中幾何形狀變化的影響。

中醫將骨質疏松癥歸于“骨痿”或“骨痹”的范疇[23]。中醫理論方面認為，骨質疏松癥的發生與脾腎密切相關，腎虛是其根本原因，脾虛是主要因素之一，兩臟俱虛，可共同導致該病的發生[24]。《靈樞·經絡》篇曰：“足少陰氣絕，則骨枯……骨不濡則肉不能著也；骨肉不相親則肉軟卻……發無澤者骨先死”。骨的生長、發育、強勁、衰弱與腎精盛衰關系密切，腎精為骨髓生化之源，骨骼得以滋養；腎精虧虛則骨骼失養而痿弱無力[25]?！端貑枴ぬ庩柮髡摗吩唬骸八闹韵須庥谖福坏弥两洠匾蛴谄⒛水數孟硪病?。脾為后天之本，主運化，運化不力則脾精不足，腎精乏源，而致骨痿；脾氣虛，津液不布，倦怠乏力，肌肉消瘦而致骨痿[26]。補腎健脾益氣法是骨質疏松癥治療的重要法則[27]。前期研究表明，補腎健脾益氣法能夠提高酒精性骨質疏松大鼠骨密度和骨礦含量，抑制骨礦丟失[28]，同時又能夠上調小腸組織內VDR mRNA的表達，提高對1,25-(OH)2D3的反應活性，促進腸鈣、磷的吸收，促進骨形成，抑制骨丟失，有效改善骨代謝，提高骨質量，改善骨強度和硬度，提高骨生物力學指標[10]。生髓健骨膠囊針對“脾腎相關論”及對酒精性骨質疏松的病機特點，由《醫學正傳》里的鹿角丸化裁而來，方中龜板、鹿角膠補先天為君，補腎壯骨、填精生髓。鹿角膠益精血，偏補腎陽；龜板性補腎養陰，偏補腎陰，一陰一陽，二藥合用，以達陰陽并補之功?！夺t經精義》曰：“精足則髓足，髓在骨內，髓足則骨強”。生黃芪、熟地、當歸、白術培補后天為臣。生黃芪、熟地黃二藥相伍，滋陰健脾，益氣養血。黃芪、當歸兩藥相合配伍，則氣旺血生，陽生陰長。生黃芪、熟地、當歸合用可助君藥生補精血之功。白術健脾燥濕利水，可針對酒毒痰濕之疾。葛根、郁金、地龍、牛膝、丹參為佐藥，牡蠣、龍骨合為使藥，全方標本兼顧，配伍緊密，具有補腎生髓、健脾益氣、健骨養陰、活血止痛之功效[29]。

本研究各組大鼠左側股骨生物力學指標測定結果顯示，模型組與空白組比較，大鼠股骨的最大載荷、極限強度、最大撓度、彈性模量均顯著降低(P<0.01)，這說明大鼠在白酒灌胃后生物力學性能均下降。中藥干預組和西藥對照組均有不同程度改善(P<0.05)。中藥干預組最大載荷、極限強度、最大撓度均優于西藥對照組，而彈性模量經比較差異無統計學意義(P>0.05)，這可能在制備游離樣本時破壞了骨小梁的邊界結構連接。另外，如施加的壓力與骨正常受力方向不一致，也會導致較小的彈性模量。這說明大鼠在白酒灌胃后隨著骨質含量的逐漸下降，骨生物力學性能也不斷下降。應用生髓健骨膠囊會使骨生物力學性能的各項指標，如最大載荷、極限強度、最大撓度、彈性模量明顯改善，提高骨硬度和骨彈性，通過中西藥對AOP大鼠的治療作用進行對比分析，以期為骨質疏松發生過程中脾腎相關性研究提供實驗依據，值得進一步運用現代分子生物學技術深入研究其作用機制及藥理作用。