育齡婦女不同同型半胱氨酸水平與葉酸代謝關鍵酶基因多態性分布研究

陳博 孫曉巖 袁細妹

出生缺陷是指子宮內胎兒因多種原因而發生解剖學上和功能上的異常, 臨床上主要表現為兔唇、四肢異常、聾啞、白血病等。該類疾病發病率高, 可占活產兒的3%［1］。出生缺陷發病多與生殖道感染、內分泌異常、外部用藥等密切相關, 目前研究發現, 出生缺陷患兒常伴有母體葉酸代謝功能紊亂、Hcy血漿內水平偏高, 其中葉酸代謝關鍵酶基因多態性在出生缺陷方向的研究逐漸得到關注［2］, 但其與Hcy兩者的關系研究卻比較少。本研究選取2016年1月~2017年12月來本院進行孕前或孕期體檢的高Hcy水平的育齡婦女和Hcy水平正常的健康育齡婦女作為研究對象, 分析葉酸代謝關鍵酶基因多態性分布與Hcy水平的關聯。現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2016年1月~2017年12月來本院進行孕前或孕期體檢173例高Hcy水平(>15 μmol/L)育齡婦女作為實驗組, 另選同期210例進行孕前或孕期體檢的Hcy水平正常的健康育齡婦女作為對照組。所有研究對象均完成遺傳檢測、Hcy檢測, 熟悉了解本研究內容并積極配合研究；排除合并心臟、肝臟、腎臟等重大器官疾病的患者；排除合并有惡性腫瘤、血液系統以及免疫系統疾病的患者；排除含有糖尿病、消化系統疾病患者。

1. 2 方法

1. 2. 1 同型半胱氨酸檢測 分別于晨起收集兩組育齡婦女空腹肘靜脈血5 ml, 上下顛倒5~8次充分混勻, 于2 h內以3000 r/min離心20 min, 分得血漿。使用日立7600全自動生化儀進行檢測, 按照試劑盒說明書操作步驟完成Hcy檢測,其中Hcy在5~15 μmol/L濃度范圍內視為正常。

1. 2. 2 基因型檢測 對所有受檢者空腹抽取外周靜脈血5 ml, DNA通過柱式抽提試劑盒進行抽提, 提取結束后并進行DNA濃度測定。MTRR A66G、MTHFR A1298C及C677T的基因多態性采用Mass ARRAY技術進行SNP分型檢測, 利用MASS ARRAY的引物設計平臺設計PCR引物, 包括一對多重PCR擴增引物, 及一條MASS EXTEND延時引物。然后進行聚合酶鏈反應, 每個反應體系總體積為5 μl, 1 μl包含濃度為 20 ng/μl的 DNA模板 , 1.8 μl無酶水 , 0.5 μl 10X PCR buffer, 0.4 μl 25 μM MgC12, 0.1 μl 25 μM dNTP Mix, 1 μl 0.5 μM Primer Mix, 0.2 μl 5 U/μl PCR Enzyme。 設 定 反 應 條 件 為 ：95℃ 2 min, 然后再完成20個循環的擴增(95℃ 30 s, 56℃ 30 s,72℃ 1 min)與45個循環的擴增。結束整個反應過程之后得到的PCR產物經過樹脂純化后在Nanodispenser Spectro CHIP芯片上點樣, 然后進行Mass ARRAY 分析, 每個檢測點只需3~5 s, 進行全自動分析, 通過TYPPER4.0軟件分析實驗結果。

1. 3 觀察指標 比較兩組育齡婦女葉酸代謝關鍵酶(MTHFR酶和MTRR酶)基因型頻率分布的差異。分析兩組育齡婦女H-W 遺傳平衡結果。

1. 4 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件進行數據分析。計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗；按照Hardy-Weinberg(H-W)平衡法檢測樣本的群體代表性。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 兩組育齡婦女H-W 遺傳平衡結果 將H-W遺傳平衡檢驗應用于兩組患者基因分析, 結果可得, 各位點基因頻率實際值與預計值分布情況差異無統計學意義(P＞0.05), 即取樣樣本具有群體代表性。

2. 2 兩組育齡婦女葉酸代謝關鍵酶基因型頻率分布情況實驗組MTHFR C677T的TT基因型、MTHFRA1298C的AA基因型分布頻率分別為68.2%、87.3%明顯高于對照組的13.8%、65.2%, MTRR A66G 的AA基因型分布頻率為48.0%明顯低于對照組的60.0%, 差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組育齡婦女葉酸代謝關鍵酶基因型頻率分布情況［n(%)］

3 討論

葉酸作為一碳單位重要載體, 在甘氨酸、絲氨酸以及Hcy體內代謝過程中, 發揮重要作用, 同時也參與到DNA以及血紅蛋白的合成過程當中［3］。葉酸代謝過程關鍵酶MTHFR和MTRR參與到Hcy向蛋氨酸(Met)轉化以及DNA合成的過程, 其代謝改變可嚴重擾亂機體葉酸代謝網絡［4-7］。目前, 葉酸代謝關鍵酶主要集中于基因多態性研究, 但其與高Hcy水平兩者的關系的研究卻較少。本研究則采用對比分析的研究方式分析育齡婦女Hcy水平與葉酸代謝酶基因分布關系, 為不良妊娠的分析提供參考。

體內Hcy水平偏高嚴重影響血管增殖以及相應的修復功能, 進而引發孕期婦女體內胎兒發生血管病變以及凝血系統障礙等, 而葉酸代謝相關酶在體內Hcy水平的維持中十分重要。MTHFR酶可催化同型半胱氨酸進行甲基化生成Met, 保持Hcy處于體內平衡, 其中MTHFR酶的C677T 和A1298C基因位點在不良妊娠的研究中得到廣泛關注［8-11］。MTRR是Met合成酶的輔助因子, 同樣維持體內Hcy水平, 其中MTRR的A56C和A66G兩個基因位點改變可引發Hcy含量升高［12-14］。馬國海等［15］通過對766例育齡婦女研究發現,不同Hcy水平患者MTHR和MTRR基因頻率分布存在明顯不同, 本研究發現, 實驗組MTHFR C677T的TT基因型、MTHFRA1298C的AA基因型分布頻率分別為68.2%、87.3%明顯高于對照組的13.8%、65.2%, MTRR A66G 的AA基因型分布頻率為48.0%明顯低于對照組的60.0%, 差異有統計學意義(P<0.05)。與上述結果基本一致。MTHFR C677T可使得體內的丙氨酸(A)-纈氨酸(T)轉換增加, AT或TT基因型發生改變, 代謝酶水平發生改變, Hcy含量水平升高, 其中純合子TT基因型改變可使酶的活性降低達70%左右。

MTRR 催化甲基鈷胺再生, 是蛋氨酸合成酶的輔助因子,蛋氨酸合成酶對于維持蛋氨酸和四氫葉酸在細胞內水平及維持Hcy 在無毒性的水平具有重要作用。MTRR 的A66G變異會導致MTRR表達降低, 引起Hcy 的血漿水平升高。本研究顯示, 觀察組和對照組MTRR 的這兩個位點基因分布頻率差異具有統計學意義(P＜0.05)。

綜上所述, 葉酸代謝關鍵酶基因, 即MTHFR C677T位點、MTHFRA1298C位點和MTRR A66G 位點的突變是引起育齡婦女血漿HCY升高的重要原因之一, 可能與不良妊娠相關。可見, 對育齡婦女進行孕前葉酸代謝通路關鍵酶基因變異檢測, 并結合血漿同型半胱氨酸水平檢測, 有助于個體進行個體化葉酸補充方案, 提高補充葉酸的依從性, 預防出生缺陷的發生。