致牛肉醬生膜菌的分離鑒定及其生膜能力驗證

郭壯，董蘊，尚雪嬌，倪慧，周明會，張振東*

(1.湖北文理學院 化學工程與食品科學學院 鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.襄陽農錦食品有限公司，湖北 襄陽 441053)

牛肉醬使用牛肉為主要原料，添加天然香辛料，經蒸、煮、熬等多道工序精制而成，營養全面均衡，在全國范圍內均有消費市場。鮮肉經過熱加工制成各種熟肉制品后理應不含菌體，但是由于工藝或者其他原因，可能會有微生物在牛肉醬中殘留下來，進而在后期貯藏中產生生物膜和腐敗。生膜微生物在牛肉醬中進行繁殖，不僅影響到牛肉醬的外觀、氣味、滋味。有些微生物還可能會產生一些毒素，一些侵襲性的微生物還可能會造成食物中毒等事件，危及到食用人群的健康。由于很多種酵母對低溫有很好的適應性，因此冷藏通常只能減緩食品腐敗的發生[1]。

通常情況下，引起肉類食品生膜腐敗的微生物有霉菌、酵母和細菌。牛肉醬是一種高油和高蛋白含量的食品，所以能引起牛肉醬腐敗的微生物通常能分解油脂，能夠利用蛋白質來獲取能量。研究表明，醬肉中的腐敗菌以腸桿菌屬微生物、芽孢桿屬、微球菌群等細菌微生物與絲狀真菌和酵母為主。引起食品腐敗的酵母有：高鹽的大頭菜中Candidapararugosa，Candidazemplinina等腐敗酵母[2]，引起糖漿、醬油等食品腐敗的Candidapelliculosa，Candidalambica，Geotrichumcandidum[3]，能夠利用脂肪而引起高脂肪食品腐敗的Candida，Cryptococcus，Geotrichum與Rhodotorula等。本文從襄陽市區牛肉醬企業收集到1瓶生膜牛肉醬樣品，采用傳統可培養方法對生膜微生物進行了分離與鑒定，使用分子生物學方法對分離到的微生物進行了鑒定，并驗證了它們對牛肉醬的生膜能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牛肉醬

2017年9月從湖北省襄陽市牛肉醬生產企業收集的生膜牛肉醬1瓶及剛加工的新鮮牛肉醬1000 g。

1.1.2 培養基

LB培養基配方：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1000 mL，調節pH至7.2；PDA培養基：使用合成培養基(海博，青島)；YPD培養基配方：1% 酵母膏，2% 蛋白胨，2%葡萄糖，調節pH至7.2。

1.1.3 主要儀器

電子天平 賽多利斯公司；-70 ℃冰箱、生物安全柜 青島海爾股份有限公司；組織研磨器 美國Biospec公司；隔水式培養箱 上海博訊實業有限公司；離心機 日本日立公司；PCR儀 美國ABI公司；恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牛肉醬生膜菌的分離與純化

生膜細菌的分離采用傳統的平板劃線法進行：取生膜牛肉醬1塊，將接種環在酒精燈上灼燒滅菌、冷卻后，挑取生膜醬塊上的含生物膜菌團，劃線于LB固體平板上培養3～5天。根據菌落形態的不同，挑取菌落形態具有差異的菌，并在LB固體平板上劃線純化至少3次，然后將純化的細菌進行染色鏡檢后使用30%甘油于-40 ℃冰箱保存。

生膜真菌的分離方法同生膜細菌：取生膜牛肉醬，挑取生膜醬塊上的菌膜，劃線于PDA固體平板后于25 ℃培養3～5天。根據菌落形態的不同，挑取菌落形態具有差異的菌，并在PDA固體平板上劃線純化至少3次，然后使用30%甘油于-40 ℃冰箱保存。在保存前，將純化過的微生物未染色直接鏡檢與染色鏡檢。

1.2.2 牛肉醬腐菌DNA提取

牛肉醬中生膜菌的鑒定：將純化過的微生物培養1～2天后收獲菌體，將菌體使用TE緩沖液重懸，并加入0.2 g玻璃珠(直徑0.5 mm)后在組織研磨器中破碎菌體細胞，接著加入10% SDS、蛋白酶K，于55 ℃水浴90 min后，使用酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)抽提1次，接著使用氯仿-異戊醇(24∶1)抽提1次后取上清，加入2倍體積無水乙醇沉淀DNA，然后晾干并用無菌TE緩沖液溶解DNA，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，保存于-20 ℃冰箱備用[4]。

1.2.3 牛肉醬腐菌的鑒定

使用酵母菌26S rDNA的D1/D2區通用引物NL1(5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′)與NL4 (5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′)[5]，以提取的生膜菌總DNA為模板進行PCR擴增，將PCR產物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用AxyPrep PCR清潔試劑盒純化，并連接到pMD18-T克隆載體后，轉化到Top10大腸桿菌感受態細胞。接著使用M13引物，取在LB液體(含氨芐青霉素)過夜培養的克隆子進行PCR，并用1.5%瓊脂糖凝膠對克隆子進行驗證，然后挑取陽性克隆子送南京金絲瑞生物科技有限公司測序。待測序后，將去除引物NL1與NL4的序列在NCBI數據庫進行BLAST比對，選取最相近的序列與分離到的菌株序列一起構建系統發育樹，分析生膜菌的系統發育地位。

1.3 生膜菌對牛肉醬的生膜能力

取正常加工的牛肉醬100 g分裝于玻璃瓶中，首先進行巴氏殺菌。待牛肉醬冷卻后，接入培養好的菌液，并于25 ℃培養，每天觀察牛肉醬的情況，待牛肉醬生膜后，進行拍照并描述牛肉醬的組織狀況。

2 結果

2.1 牛肉醬腐菌的分離與純化

劃線分離與倍比稀釋法是分離微生物的基本方法，許多研究都采用這些方法對傳統發酵食品中的微生物進行分離。本研究使用劃線分離法對牛肉醬中的生膜微生物進行了分離與純化。從PDA固體平板上微生物LJJ11，從LB培養基上獲得了3株微生物LJJ1、LJJ2、LJJ3。分離到的4株微生物在PDA固體平板上的菌落形態及它們的鏡檢圖片見圖1。

圖1 牛肉醬生膜菌形態Fig.1 The morphology of biofilm-forming yeasts

通常情況下，LB培養基主要用來分離與純化細菌。由圖1可知，從LB固體培養基上分離到的3株微生物LJJ1、LJJ2、LJJ3與LJJ11顯微形態一致，菌體細胞大小明顯大于普通的細菌，推斷分離到的4株菌均為酵母菌。單個酵母細胞呈卵圓形，而多個細胞聚集在一起時，出現不規則的多邊形菌體，酵母細胞可被結晶紫染色，染色后在顯微鏡下酵母細胞呈卵圓形。在PDA固體平板上生長2天后，這4株菌的菌落形態均表現為白色凸起，奶油樣外觀，菌落周圍整齊，表面光滑濕潤。

2.2 生膜酵母的PCR擴增

對酵母菌LJJ1、LJJ2、LJJ3與LJJ11菌體總DNA進行了提取，然后使用真菌26S rDNA基因D1/D2區通用引物NL1與NL4進行了PCR擴增。PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2，可知PCR產物片段約為600 bp，符合真菌26S rDNA基因D1/D2區段大小，可以進行下一步的克隆并進行測序。

圖2 生膜酵母26S rDNA基因D1/D2區PCR產物凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of D1/D2 region of 26S rDNA gene of biofilm-forming yeasts

2.3 生膜酵母的鑒定

酵母菌大亞基上26S rDNA分子，可分為 D1、D2～D12等多個區域，其中D1/D2區域，序列相對比較保守，長度為600 bp左右。而酵母18S rDNA序列長達1800 bp，測序較繁瑣，且多數酵母菌均能使用26S rDNA中Dl/D2區進行區分[6]。針對26S rDNA基因D1/D2區仍然無法區分的酵母，可采用ITS間區或者一些持家基因如TEF1，CYTB，RPB等序列加以區分[7,8]。

使用通用引物NL1與NL4通過PCR獲得了分離到的4株酵母的26S rDNA基因D1/D2區序列，并將這些序列在NCBI進行BLAST比對，結果見表1。

表1 分離到的4株酵母NCBI BLAST比對結果Table 1 NCBI Blast of isolated 4 yeast strains

由表1可知，4株菌與Candidametapsilosis(近平滑假絲酵母)序列相似度最高。但是與Candidametapsilosis，Candidaparapsilosis，Candidaorthopsilosis3個種的酵母菌株序列相似度也超過了99%。有研究人員將Candida屬一些生理生化性狀相似，26S rDNA基因D1/D2區序列相似的酵母菌組成一個Candidaparapsilosiscomplex[9]，而系統發育分析也證實了它們的同源性較高，在系統發育樹上能聚成一個分支。

從NCBI數據庫下載序列相似度超過98%的序列，與分離到的4株酵母菌序列一起構建系統發育樹，進行系統發育分析以確定它們的分類地位，見圖3。

圖3 基于生膜菌26S rDNA D1/D2區序列的NJ系統發育樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of biofilm-forming yeasts based on D1/D2 region 26S rDNA gene

由圖3可知，它們與Candidametapsilosis系統發育關系最近，并與Candidaparapsilosis，Candidametapsilosis，Candidaorthopsilosis聚成一個分支，表明它們都屬于Candidaparapsilosiscomplex。這4株酵母菌26S rDNA基因D1/D2區序列的系統發育關系分析表明，它們均屬于Candidametapsilosis，而它們的菌落形態與顯微鏡下的形態與Candidaparapsilosiscomplex符合，因此綜合分子生物學方法和傳統培養方法，這4株酵母菌均屬于Candidametapsilosis，為Candidaparapsilosiscomplex的一個分支。

目前國內對Candidaparapsilosiscomplex的研究仍然較少，國外的研究主要針對Candidaparapsilosiscomplex的感染性與分類方面。2004年，基于ITS等序列的MLST分析，Tavanti等[10]將Candidametapsilosis與Candidaorthopsilosis一起確立為種水平上的新分類單元。2007年，Gácser等[11]指出，C.orthopsilosis與C.parapsilosis對人體組織的損傷程度較為相似，而C.metapsilosis的毒性更小一些。Candidaparapsilosiscomplex是人類皮膚表面的一種正常菌群之一，常可在指甲下間隙分離到。但是它們也是一種機會致病菌，感染之后能導致多種疾病：真菌血癥、心內膜炎、腹膜炎、關節炎和內眼炎等的發生。

2.4 分離菌的生膜性分析

將生膜菌接入新鮮的經過滅菌的牛肉醬中，在25 ℃常溫培養7天后，牛肉醬的外觀發生了顯著變化，見圖4。

圖4 生膜菌致牛肉醬腐敗實驗Fig.4 Experiment of spoilage of beef sauce caused by biofilm-forming bacteria

牛肉醬肉塊表面長滿了黃色的菌膜，且LJJ1、LJJ2、LJJ3與LJJ11 4個處理的牛肉塊表面的組織狀態類似。而對照未接菌處理的牛肉醬表面仍然保持與第0天的牛肉醬組織狀態一致，說明分離到的4株Candidaparapsilosiscomplex中Candidametapsilosis酵母確實是引起這種牛肉醬生膜的微生物。

Candidaparapsilosiscomplex能產生多種代謝產物，如谷胱甘肽、GABA及各種酶如木糖還原酶等，還可用于肉類發酵，有較好的應用價值。將Candidaparapsilosis與普洱茶共發酵，發現接種菌株的普洱茶樣品的GABA含量顯著較高[12]。也有研究人員使用Candidaparapsilosis進行(S)-苯基乙二醇的生物制備[13]。

與其他食品不同，牛肉醬是一種高油脂、高蛋白及高鹽食品。據報道，一些酵母能產生豐富的蛋白酶，降解肉類制品中的蛋白質產生低分子量的硫化物如H2S和SO2，造成食品的營養價值與氣味變化。這些酵母多為Candida屬，如Candidazeylanoides和Candidaalimentaria，而關于Candidametapsilosis對造成肉類食品生膜的報道尚少。

3 總結

酵母菌是一種常見的腐敗菌，能導致肉類、果蔬、面食等的腐敗。本研究從腐敗的牛肉醬肉塊上分離到的4株微生物均為酵母菌，經過菌落形態、顯微細胞細胞形態的觀察及系統發育分析得出它們均屬于Candidametapsilosis，且它們均能導致新鮮無菌牛肉醬產生黃色膜狀腐敗。