D?半乳糖誘導小鼠原代皮膚成纖維細胞衰老模型的建立*

張 鑫，黎 靜，魯 晴，黃華生，林毓君，唐春女，潘璐璐，莫書榮（廣西醫科大學生理教研室，廣西南寧 530021）

隨著我國人口數量的不斷增加，人口老齡化問題逐漸突出，因此衰老性疾病和亞健康的衰老性疾病等隨之而來。抗衰老研究及如何預防和延緩年齡相關疾病的發生和發展將有利于提高人們的生活質量，減少其家庭的經濟負擔，已逐漸成為醫學界關注的熱點。衰老最先表現為皮膚衰老，皮膚是人體最大的器官，由表皮、真皮和皮下組織構成，其中真皮為皮膚提供各種營養物質，成纖維細胞是真皮的主要細胞組成，維系著皮膚正常的生理結構和功能[1]。衰老的皮膚在結構和功能上將發生改變[2-3]。因此，皮膚成纖維細胞衰老模型在研究衰老機制、表現及篩選延緩衰老藥物起著重要作用。本研究旨在建立成纖維細胞（MSF）衰老模型，為開展皮膚衰老及老年相關疾病的研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取5～7 d昆明乳鼠，購自廣西醫科大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 高糖DMEM培養基（美國Gibco公司）、Ⅰ型膠原酶（美國Invitrogen公司）、β-半乳糖苷酶細胞衰老染色試劑盒（上海碧云天公司）、鼠抗Vimentin單克隆抗體（武漢博士德公司）、鼠抗Sirt1單克隆抗體（SANTA CRUZ公司）、逆轉試劑盒（Thermo公司）、液體DAB酶底物顯色試劑盒（福州邁新生物技術有限公司）。4，6-二脒基-苯基吲哚（DAPI）（Solarbio公司）

1.2 方法

1.2.1 MSF的培養 取5～7 d的昆明乳鼠，用75%乙醇浸泡消毒30 min，用消毒過的手術剪分離乳鼠的背部皮膚5 cm×3 cm，將分離下來的皮膚置于10 cm的培養皿中，用含1%青霉素-鏈霉素的去離水磷酸鹽緩沖液（DPBS）清洗 2次，吸凈DPBS，去除血管脂肪，用手術剪將皮膚組織剪碎并將組織碎塊轉移到15 mL離心管內，然后加入10 mL的0.1%Ⅰ型膠原酶（無血清的高糖DMEM培養基），并吹打使得皮膚組織碎塊分散，將離心管放入到CO2細胞培養箱中消化90 min，并且每隔30 min振蕩搖晃離心管1 min。消化完后離心機以1 500 r∕min速率離心5 min，棄上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM清洗2次，以1 000 r∕min離心速率離心3 min，棄上清，再用含15%胎牛血清的高糖DMEM重懸組織塊并用70 μm的濾篩過濾，將濾液轉移到培養瓶，并放入二氧化碳（CO2）細胞培養箱中培養，隔天換液。

1.2.2 MSF的鑒定 采用形態學觀察法觀察MSF的形態特征；Vimentin蛋白采用細胞免疫組化法分析MSF，具體方法如下，將培養板中長好MSF的玻片用PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定爬片15 min，PBS清洗3次；0.5%Triton X-100室溫通透20 min；加滴一抗波形蛋白抗體。用PBS清洗，滴加生物素標記的二抗，PBS沖洗。滴加鏈親和素-過氧化酶溶液孵育。DAB顯色，用蘇木素復染，用中性樹膠封固，在顯微鏡下采集圖像。

1.2.3 D-半乳糖誘導細胞衰老 將生長狀態良好的MSF接種于6孔板，用高糖DMEM培養基、37℃CO2培養箱培養。待細胞融合70%～80%，給予含有不同濃度 D-半乳糖（10、20、30 g∕L）的完全培養基，分別培養0、24、48 h。

1.2.4 β-半乳糖苷酶染色實驗 按照β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書進行實驗操作，具體方法如下：吸棄舊的培養基，用DPBS清洗1次，加入1 mL染色固定液，室溫固定15 min；吸棄固定液，用DPBS清洗3次，每次3 min；吸棄DPBS，每孔加入1 mL染色工作液，用保鮮膜蓋住6孔板，然后放置于37℃恒溫箱中孵育過夜。甘油封閉鏡下觀察，各組隨機計數400個細胞中的陽性細胞數，計算陽性細胞率（%）。

1.2.5 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測p53基因表達 D-半乳糖（20 g∕L）分別誘導 MSF 0、24、48 h，采用Trizol法提取細胞總RNA并進行RT-PCR，采用熒光定量染料法檢測p53 mRNA表達水平（上游引物：AGTCCTTTGCCCTGAACTGC，下游引物：GCGGATCTT GAGGGTGAAAT），每個樣本重復測量3次，以GAPDH（上游引物：CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT，下游引物：AGCCTTCTCCA TGGTGGTGAAGAC）為內參參照標準，按照2－△△Ct計算p53基因相對表達量。

1.2.6 細胞免疫熒光觀察Sirt1基因在MSF中的表達 D-半乳糖（20 g∕L）分別誘導 MSF 0、48 h，將培養板中爬好MSF的玻片用PBS清洗3次，每次3 min；4%多聚甲醛固定爬片15 min，用PBS清洗3次，每次3 min；0.5%Triton X-100室溫通透20 min；用PBS清洗3次，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，并滴入足量稀釋好的一抗小鼠單克隆抗體Sirt1，放入濕盒，在4℃孵育過夜；用PBST浸洗爬片3次，并吸干液體，滴入稀釋好的熒光二抗，黑暗條件下20～37℃濕盒孵育1 h，PBST洗3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，用PBST清洗；用含抗熒光淬滅劑的封片液封閉，在熒光顯微鏡下采集圖像。

1.3 統計學處理 所有實驗均重復3次，計量資料以表示，應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析。多組間比較應用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察MSF形態學變化 光鏡下可見細胞胞體較大，胞核較大呈橢圓形，染色質疏松著色淺，核仁明顯，為多突的梭形或星形的扁平細胞，具有突起，符合皮膚MSF的形態學特征。見圖1。

圖1 原代成纖維細胞形態及鑒定（4×）

2.2 Vimentin蛋白免疫組織化學分析 Vimentin蛋白免疫組織化學結果顯示，原代培養細胞中Vimentin蛋白呈陽性表達。見圖2。

圖2 MSF Vimentin蛋白免疫組化分析（4×）

2.3 β-半乳糖苷酶染色分析 β-半乳糖苷酶染色后，衰老細胞呈藍色，陰性細胞無著色。不同濃度D-半乳糖誘導MSF 0、24、48 h后，陽性細胞的百分比均顯著高于0 g∕L，并且呈現一定的時間和濃度依賴性。見圖3、4。

圖3 不同濃度D-半乳糖誘導MSF后β-半乳糖苷酶染色情況（100×）

圖4 不同濃度D-半乳糖誘導MSF后β-半乳糖苷酶染色陽性細胞數分析

2.4 p53基因表達水平檢測 D-半乳糖誘導24、48 h后MSF p53 mRNA表達較0 h時表達顯著升高（P＜0.01）。見圖5。

圖5 D-半乳糖誘導衰老后MSF中p53基因表達變化情況

2.5 Sirt1細胞免疫熒光檢測 細胞免疫熒光分析細胞Sirt1蛋白表達，Sirt1標記為綠色，DAPI標記細胞核為藍色熒光，融合后，發生重疊，Sirt1主要表達在細胞核，但是D-半乳糖誘導48 h后Sirt1的表達明顯降低。見圖6。

圖6 皮膚MSF Sirt1免疫熒光染色結果（200×）

3 討 論

細胞衰老是指細胞在執行生命活動過程中隨著時間的推移，細胞增殖分化能力和生理功能逐漸發生衰退的變化過程，是正常細胞的必然歸宿[4]。衰老細胞雖然仍保留一些細胞的基本代謝活性，但在細胞形態和功能上都已發生了很多根本性的改變。例如，細胞皺縮，膜通透性、脆性增加，核膜內折，細胞器數量減少，胞內出現脂褐素等異常物質沉積。衰老細胞同樣擁有一些共同特點，主要表現在細胞增殖抑制、細胞周期阻滯、β-半乳糖苷酶活性增高等細胞功能的一系列變化[5]。目前，有研究表明，D-半乳糖所致衰老與自然衰老變化相似[6]。D-半乳糖是體內正常的營養成分，能夠通過轉變為葡萄糖，參與正常能量的代謝，如果D-半乳糖攝入過量則會導致機體多器官功能代謝紊亂，甚至產生對基因的表達和調控情況[7]。D-半乳糖使機體產生大量自由基，抗氧化能力減弱，脂質水平增加，從而導致機體引起亞急性衰老[8]。D-半乳糖衰老模型的涉及領域較廣，不僅涵蓋器官、組織和細胞形態學改變，還在信號通路的蛋白基因水平上均有研究[9]，已成為研究衰老的經典細胞模型。

p53基因是一種與細胞生長、凋亡、衰老和DNA修復相關的重要基因。有研究發現，抑制p53基因的表達可以減少皮膚細胞的凋亡，并且延緩皮膚的衰老[10-12]。Sirt1基因是酵母長壽基因Sirt2的同源基因，參與了基因轉錄、能量代謝及細胞衰老等生理功能調節，Sirt1通過與蛋白的相互作用可抑制p53基因表達來調控細胞的凋亡進程，從而發揮對基因的調控作用[13]。在衰老過程中，Sirt1表達水平的降低可以增強p53的表達，從而加速細胞的凋亡和衰老[14]。

在衰老過程中，MSF的功能、形態和增殖潛力等方面發生了顯著變化，并對皮膚的功能及穩態具有重要影響[15]。本研究采用Ⅰ型膠原酶消化法原代分離獲得MSF，在倒置顯微鏡下觀察細胞呈紡錘形或星形的扁平細胞，符合皮膚成纖維細胞的形態學特征。同時，原代培養細胞中Vimentin蛋白呈陽性表達，進一步提示原代分離培養的細胞為MSF。本研究通過D-半乳糖法建立細胞衰老模型，結果表明，D-半乳糖作用MSF后，可使MSF β-半乳糖苷酶陽性染色細胞數量明顯增多、p53基因表達增強、Sirt1基因表達降低等細胞衰老的相關表現。

綜上所述，本實驗通過Ⅰ型膠原酶消化法建立了MSF培養方法，并通過D-半乳糖誘導法建立了MSF衰老模型，為開展皮膚衰老及老年相關疾病的研究提供了實驗基礎。