桉葉油含藥血清聯合維甲酸對體外培養神經干細胞Pax3及Cx43的影響*

胡曉芳，余永莉，陳 濤，張彬渝，劉茂生，蘇麗莉（遵義醫學院珠海校區人體解剖與組織胚胎學教研室，廣東珠海519041）

桉葉油是從桉樹葉中提取的具有芳香味的揮發性油，具有抗菌、抗氧化、抗炎、促滲透、殺蟲、驅蚊、止癢及防腐作用[1]。有文獻報道，桉葉油能舒張氣管和血管平滑肌、心肌，其作用機制可能是影響膜上離子通道的離子流[2-4]。本課題組前期研究發現，桉葉油對維甲酸（RA）導致胎鼠神經管缺陷有一定的拮抗作用，其機制可能與桉葉油拮抗RA上調胎鼠神經組織的Pax3、Cx43蛋白過度表達有關。本研究利用桉葉油制備含藥血清，聯合RA作用體外培養神經干細胞，通過檢測細胞Pax3、Cx43基因表達水平，從體外實驗探討桉葉油是否也具有拮抗RA上調胎鼠神經組織的Pax3、Cx43蛋白表達的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇SPF級SD大鼠，體重180～220 g[購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物合格證號編號：0094460，許可證號：SCXK（粵）2008-0002]；飼養條件：室溫24～27℃，通風，相對濕度68%～80%，每天光照12 h，自由攝食、飲水。

1.1.2 藥品及試劑 RA粉末原料藥（北京貝利萊斯生物化學有限公司，批號：110801），桉葉油[桉葉素99.5%，德信行（珠海）香精香料有限公司，批號：110626]；選用金龍魚花生油作為藥品溶劑。

1.2 方法

1.2.1 桉葉油含藥血清的制備 選擇體重250～300 g清潔級的雄性SD大鼠，將其隨機分為6組，每組3只，分別作為正常血清組（大鼠自由飲食）、溶劑血清對照組（每只大鼠早晨灌胃花生油3 mL，每天1次，連續灌胃 7 d）、桉葉油血清組（分別用桉葉油 300、1 000、1 500 mg∕kg 于早晨灌胃，每天 1 次，連續灌胃 7 d）。各組末次灌胃后2.5 h左右，用10%的水合氯醛進行麻醉，解剖胸腔，用一次性無菌注射器心臟采血，離心，收集血清。無菌濾器過濾除菌，置于56℃水浴30 min滅活，-20℃保存備用。

1.2.2 神經干細胞培養及鑒定 在無菌條件下取24 h內新生SD大鼠的海馬組織，輕微機械吹打組織，用200目過濾網過濾、收集單細胞懸液。加入適量DMEM∕F12 全培養液[內含 2% 維生素 B27、20 μg∕L 成纖維細胞生長因子（FGF）和 20 μg∕L 表皮生長因子（EGF）]，放入37℃、5%CO2飽和濕度CO2培養箱中換液培養7 d，傳代1次，收集第2代神經干細胞，輕微吹打、吹散細胞球，制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×105mL-1接種于6孔培養板，每孔4 mL，分為BrdU標記組和對照組。BrdU 標記組加入 BrdU 10 μmol∕L，對照組加入 DMEM∕F12全培養液，培養48 h收集各孔細胞，用4%的多聚甲醛固定細胞后，采用免疫熒光法檢測BrdU、Nestin。鑒定BrdU組一抗為兔抗鼠BrdU抗體，鑒定Nestin組一抗為兔抗鼠Nestin抗體，兩組二抗均為羊抗兔異硫氰酸熒光素-免疫球蛋白G（FITC-IgG）。并設立一抗為磷酸鹽緩沖溶液（PBS）的陰性對照組。使用熒光顯微鏡觀察結果。

1.2.3 桉葉油含藥血清對體外培養胎鼠神經干細胞Pax3、Cx43表達的影響 收集第二代神經球細胞，加入新的無血清DMEM∕F12全培養液，輕微吹打、吹散細胞球，制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×105mL-1接種于培養板，分為5組，分別加入自由飲食SD大鼠血清、溶劑花生油灌胃血清、桉葉油 1 500、1 000、300 mg∕kg灌胃鼠血清，各組血清終濃度為5%。各組細胞放入37℃、5%CO2、飽和濕度條件下CO2培養箱中培養48 h，收集細胞，采用蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測細胞Pax3、Cx43蛋白表達水平，并采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測細胞Pax3、Cx43基因表達水平。

1.2.4 桉葉油含藥血清聯合RA對體外培養胎鼠神經干細胞Pax3、Cx43表達的影響 收集第2代神經球細胞，加入新的無血清DMEM∕F12全培養液，輕微吹打、吹散細胞球，制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×105mL-1接種于6孔培養板，分為6組，正常SD大鼠血清5%+RA（5 μmol∕L），溶劑花生油含藥血清 5%+RA（5 μmol∕L），桉葉油 1 500 mg∕kg 含藥血清 5%+RA（5 μmol∕L），1 000 mg∕kg 含藥血清 5%+RA（5 μmol∕L）、300 mg∕kg 含藥血清 5%+RA（5 μmol∕L），RA（5μmol∕L）。各組細胞放入37℃、5%CO2飽和濕度條件下CO2培養箱中培養48 h，收集細胞，采用Western blotting檢測細胞Pax3、Cx43蛋白表達水平，并采用RT-PCR檢測細胞Pax3、Cx43基因表達水平。

1.3 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以表示，各組均數比較采用方差分析。檢測水準α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠神經干細胞的培養及鑒定 收集新生SD大鼠海馬組織細胞在無血清的DMEM∕F12全培養液培養24 h后，肉眼可見培養瓶中有乳白色小塊狀或者顆粒狀懸浮物，鏡下觀察懸浮物為聚集的細胞塊，細胞輪廓清晰，有光澤，其周圍有懸浮的死細胞碎片，瓶底也有大量有光澤的單個細胞。換液后吹散懸浮小塊繼續培養，如此換液吹散培養到第7天，可見大量大小不等的神經細胞球。收集第2代細胞免疫熒光鑒定結果顯示Nestin、Brdu表達呈陽性（圖1），整個培養過程中無細胞貼壁現象出現。

2.2 桉葉油含藥血清對體外培養胎鼠神經干細胞Pax3、Cx43蛋白及mRNA表達的影響 用5%的血清作用細胞后，桉葉油含藥血清各組細胞的Cx43蛋白及基因表達水平較正常血清組的表達水平均高（P＜0.05），Pax3蛋白及基因表達水平較正常血清組的表達水平均低（P＜0.05）。見圖2、表1。

圖1 神經干細胞的培養與鑒定（200×）

圖2 桉葉油含藥血清作用神經干細胞48 h Pax3、Cx43蛋白表達水平

表1 桉葉油含藥血清作用神經干細胞48 h Pax3、Cx43基因表達水平相對正常血清組Pax3、Cx43基因表達改變情況

2.3 桉葉油含藥血清聯合維甲酸對體外培養胎鼠神經干細胞Pax3、Cx43蛋白及mRNA表達的影響 用5%的血清+RA作用細胞后，與單純RA組比較，血清各組Pax3蛋白及mRNA表達水平均降低（P＜0.05）；桉葉油含藥血清各組的Pax3蛋白及mRNA較正常血清組表達水平均有差異（P＜0.05）。

用5%的血清+RA作用細胞后，與單純RA組比較，血清各組Cx43蛋白及mRNA表達水平均降低；但在5%的血清+RA各組中，桉葉油各組Cx43蛋白及其mRNA與正常血清組比較無顯著差異（P＞0.05）。結合單純桉葉油血清可上調細胞的Cx43蛋白及其mRNA表達，但與RA聯合后，其對神經干細胞Cx43的影響與正常血清組比較無顯著差異（P＞0.05）。見圖3、表2。

圖3 桉葉油含藥血清聯合維甲酸作用神經干細胞48 h Pax3、Cx43蛋白表達水平

表2 桉葉油含藥血清聯合RA作用體外培養胎鼠神經干細胞48 h Pax3、Cx43 mRNA相對RA組Pax3、Cx43 mRNA表達水平改變情況

3 討 論

RA是維生素A在體內氧化代謝的產物，具有多種生物學功能，在胚胎生長發育過程中對胚胎的形成、細胞生長與分化起重要的調節作用。RA是一種很強的誘導分化劑，可誘導300多種功能蛋白質的表達。已有文獻報道，小劑量RA可誘導小鼠胚胎干細胞分化為神經元。鐘德君等[5]觀察不同濃度的RA在鼠胚神經干細胞增殖和分化中的作用，發現RA具有顯著地促進大鼠神經干細胞（NSCs）分化為神經元的作用，且 1.0 μmol∕L RA 誘導分化效果最佳。蔣震偉等[6]用 10 μmol∕L RA 處理人胚神經干細胞后，將神經干細胞移植入受損的大鼠脊髓內，發現神經干細胞在體內能替代缺失的神經元，能促進受損的脊髓功能恢復。然而，RA也是致畸因子，過量的RA可導致實驗動物的神經管畸形、腭裂、骨質疏松等等多種畸形。蔡煒嵩等[7]利用RA灌胃造大鼠神經管畸形動物模型觀察其出現神經組織畸胎瘤、脊髓裂開、脊柱裂等畸形形態學特點，發現RA可干擾神經發育導致脊柱裂、脊髓裂開和神經錯構瘤的發生。李紅麗等[8]用RA建立小鼠神經管畸形模型，體外培養神經干細胞并檢測其增殖變化，發現胚胎早期神經干細胞的數目減少及神經細胞增殖受抑制與RA致神經管畸形的發生有密切關系。由于胚胎畸形發生是先天性的，一旦發生后具有不可逆性，故其治療方法主要以預防性治療為主。不少學者利用RA造胚胎致畸模型，通過研究藥物對其的拮抗作用，來尋找有效預防治療先天畸形的方法。本課題組前期研究中利用桉葉油聯合RA灌胃SD孕鼠，探討其在預防性治療胚胎畸形中是否具有藥用價值，結果發現，桉葉油對RA引起胎鼠畸形，生長發育遲緩，骨骼發育及骨化遲緩有一定的拮抗作用[9-10]，對胎鼠腦組織的Cx43、Pax3蛋白和基因表達水平進行檢測，發現RA組胎鼠神經組織的Pax3、Cx43蛋白過度表達，桉葉油具有拮抗RA上調胎鼠神經組織的Pax3、Cx43蛋白表達的作用，但其具體機制尚不清楚。

Cx43是縫隙連接蛋白家族的重要成員，也是脊椎動物中表達最多、最廣泛的縫隙連接蛋白。縫隙連接又稱通訊連接，是細胞間物質交換和信息傳遞的通道。該通道允許離子、小分子物質等自由通過，傳遞細胞間的信息和能量，對細胞的新陳代謝、內環境穩定、細胞增殖、分化、生長調控等各方面起著重要作用。在神經系統和循環系統尚未建立或未發育完善的早期胚胎，長距離的信息傳遞難以進行，胚胎各部分細胞的增殖、分化與生長發育離不開細胞間離子信息的交換，縫隙連接異常將導致細胞分化遷移異常。有研究表明，Cx43表達及其縫隙連接功能的異常與許多神經系統疾病的病理生理過程有密切的聯系[11]。REAUME等[12]發現，Cx43無義突變可造成信息傳遞缺陷，影響神經細胞的遷移、增生及細胞凋亡過程。喻博等[13]用體外培養的胎鼠神經干細胞移植治療大鼠腦損傷，發現神經干細胞移植對腦損傷的恢復有一定作用，且與CX43的表達水平有關。WATANABE等[14]研究認為，過量RA是通過增加Cx43 mRNA的表達上調Cx43蛋白的表達，使信息傳遞發生紊亂，從而阻止細胞生長。本研究用5 μmol∕L RA作用神經干細胞48 h，也發現RA具有上調細胞Cx43 mRNA及蛋白表達的作用，5%桉葉油含藥血清聯合RA作用細胞48 h后，細胞的Cx43 mRNA及蛋白表達與單純RA組比較均顯著降低，提示桉葉油含藥血清具有拮抗RA上調細胞Cx43 mRNA及其蛋白表達的作用，而單純的5%桉葉油含藥血清作用神經干細胞48 h后，細胞的Cx43 mRNA及其蛋白表達水平增加，此結果進一步證明桉葉油含藥血清對RA上調細胞Cx43表達有拮抗作用，而非協同作用。Pax3基因屬于Pax基因家族，是重要的轉錄調控因子，在胚胎發育過程中對組織和器官的分化起著重要的調控作用。STOYKOVA等[15]研究發現，在神經管細胞開始分化之前，在整個神經管軸的頂板、側翼板及神經嵴細胞均有表達Pax3基因已表達。Pax3表達過高或過低均可導致相關疾病的發生，WU等[16]研究證明，神經嵴細胞中Pax3的持續高表達會導致小鼠腭裂和骨畸形。ZHOU等[17]研究發現，Pax3能調節Soostdc1的表達從而阻止神經嵴對骨形成蛋白的誘導，導致胚胎出現脊柱裂或腦膨出。BURREN等[18]研究發現，葉酸缺乏可致小鼠Pax3功能喪失，從而導致神經管畸形。王濤等[19]用RA及牛磺酸建立小鼠神經管畸形及干預模型，發現RA的致畸作用與Pax3基因表達的時相差異性有關。KENNEDY等[20]用低劑量的RA處理P19或小鼠胚胎干細胞，發現RA是通過上調Wnt3a、PAX3、Meox1、MyoD 和 Myogenin的表達，實現骨骼肌的成肌增強。本研究用5 μmol∕L RA作用神經干細胞48 h后，細胞的Pax3的表達也是增加的，RA聯合5%的桉葉油含藥血清作用細胞48 h后，細胞的Pax3蛋白及mRNA表達水平均降低，提示桉葉油含藥血清具有拮抗RA上調細胞Pax3蛋白和mRNA表達的作用。

本研究表明，RA具有上調神經干細胞Cx43、Pax3的表達，桉葉油含藥血清具有拮抗RA上調神經干細胞Cx43、Pax3表達的作用。此結論與本課題組前期體內實驗研究結論一致，從而進一步證明了影響Cx43、Pax3的表達可能是桉葉油含藥血清具有拮抗RA致畸作用的機制之一。